Инструкция к практическому занятию “Определение активности -амилазы слюны»
Принцип метода: Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 1,0 % раствора крахмала в миллилитрах, которое расщепляется 1мл неразведенной слюны при температуре 38 С в течение 30 мин. В норме амилазная активность слюны равна 160-320. Амилазная активность обозначается А 38/30`. Этот метод широко используется для определения амилазной активности мочи.
Материальное обеспечение: 0,1% раствор крахмала; 0,1% раствор йода в 0,2% растворе йодида калия; термостат; пипетки вместимостью от 1 до 10 мл.
Ход работы
-
В мерную пробирку соберите 1 мл слюны и разведите ее дистиллированной водой в соотношении 1:9.
-
В предварительно пронумерованных десять пробирок добавьте по 1 мл воды, в первую пробирку добавьте также и 1 мл разведенной в 10 раз слюны.
-
Содержимое первуй пробирки перемешайте, наберите 1 мл смеси в пипетку и перенесите эту смесь во вторую пробирку.
-
Содержимое второй пробирки перемешайте, наберите 1 мл смеси и перенесите ее в третью пробирку, и так далее до десятой пробирки.
-
Из десятой пробирки отберите 1 мл смеси и вылейте.
-
Во все пробирки добавьте по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешйте.
-
Пробирки поместите в термостат при 38 С на 30 минут.
-
Через 30 минут охладите пробирки под водопроводной водой, добавьте в каждую по 1 капле 0,1% раствора йода и перемешайте. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвета.
-
Полученные данные занесите в таблицу.
-
Отметьте последнюю пробирку с желтой окраской, что свидетельствует о том, что гидролиз крахмала прошел в ней полностью и сделайте расчет.
|
|
Разведение слюны |
|||||||||
|
|
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:320 |
1:640 |
1:1280 |
1:2560 |
1:5120 |
1:10240 |
|
|
Пробирки |
|||||||||
|
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
5-я |
6-я |
7-я |
8-я |
9-я |
10-я |
|
Ок-рас-ка с рас-тво-ром йода |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Расчет: Отметив пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью при наименьшем количестве фермента, в данной пробирке рассчитайте амилазную активность слюны по следующей пропорции:
А мл слюны расщепило 2 мл 0,1 % раствора крахмала,
1 мл слюны расщепил х мл раствора крахмала,
где А – количество неразведенной слюны.
Например, желтоватая окраска появилась в 4-й пробирке, где слюна была разведена в 160 раз; 1/160 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала; 1 мл неразведенной слюны расщепил х мл 0,1% раствора крахмала:
Х=2х1х160 =320мл 0,1% раствора крахмала. Х= 1
Следовательно, амилазная активность слюны А 38 / 30 равна 320.
ВЫВОДЫ:
Подпись преподавателя:
Приложение 1