6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо:

6.1. Выполнить самостоятельную работу:

Составить конспект по теме занятия:

ДНК-диагностика наследственных заболеваний

Конец XX века ознаменовался созданием революционных технологий в различных сферах человеческой деятельности и, в частности, в биотехнологии и генной инженерии. Наряду с возникновением принципиально новых направлений в медицине, таких как генная терапия и генная фармакология, успешно применяются в практике современных клинико-диагностических лабораторий методы ДНК-диагностики, среди которых, безусловно, первое место занимают полимеразная цепная реакция и гибридизация ДНК. После первых лет внедрения ДНК-диагностики в практическое здравоохранение стало ясно, что в ближайшее время произойдет внедрение новых систем - биологичских чипов. Однако следует признать, что уровень информированности медицинских работников сильно отстает от современного уровня развития молекулярной генетики и, в конечном итоге, приводит к формированию причин, по которым внедрение новейших технологий, и создаваемых на их основе диагностических систем, становится весьма затруднительным.

В связи с этим авторы методического пособия постарались описать, не претендуя на подробное описание всех деталей, основные методические приемы, активно развивающиеся в настоящее время и уже нашедшие свое применение в коммерчески реализуемых наборах реактивов, тест-системах и приборах.

Выделение нуклеиновых кислот

Выделение нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) из биологических материалов человека является неотъемлемой и важной частью любого из молекулярно-генетических методов диагностики.

Этот этап в зависимости от целей исследования представлен двумя вариантами:

1. Выделение геномной ДНК из ядросодержащих клеток.

2. Выделение ДНК из биологических жидкостей (плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, слизь).

В первом случае источником ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки - лейкоциты периферической крови, клетки хориона и амниотической жидкости, клеточные культуры. Для проведения анализа обычно требуется от нескольких нанограммов (10^-9 кг), до нескольких микрограммов (10^-6 кг) ДНК в зависимости от цели исследования. При этом клеточного материала требуется сравнительно немного, например 1 мл крови, 20-40 мг хориона, 5-10 мг культуры клеток. Важным является то, что геномная ДНК одинаково пригодна для различных методов исследования и может долго сохраняться в замороженном виде.

Выделение ДНК из биологических жидкостей необходимо лишь в некоторых случаях, например для определения циркулирующих в крови вирусов или ДНК разрушившихся клеток.

Наиболее распространенным методом выделения ДНК является метод фенольной депротеинизации, который одинаково пригоден для выделения ДНК из ядросодержащих клеток и из биологических жидкостей.

Методы амплификации днк и электрофоретическая детекция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - реакция матричного синтеза, в ходе которой происходит многократное копирование (амплификация) тестируемого участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов.

Разработке методики ПЦР сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать короткие одноцепочечные фрагменты ДНК - олигонуклеотиды, а также открытие термофильных микроорганизмов, живущих в горячих источниках (гейзерах). Ферментативная система экстремальных термофилов способна функционировать при высоких температурах. ДНК-полимераза этих организмов выдерживает многократное повышение температуры до 95˚С без потери биологической активности, что является необходимым условием для проведения ПЦР.

Итогом этого стала разработка сотрудником фирмы "Cetus" Кэри Мюллисом в 1983 г. полимеразной цепной реакции, за которую он в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии.

Особенно бурное развитие метод ПЦР получил в связи с программой "Геном человека", так как он позволил модифицировать методику секвенирования и ускорить процесс расшифровки последовательностеи ДНК.