Рестрикционные методы анализа генома

Рестриктазы - группа бактериальных эндонуклеаз, расщепляющих двойную цепь ДНК в специфических последовательностях нуклеотидов (сайтах рестрикции).

На сегодняшний день известно более 3000 различных рестриктаз, но в исследованиях генома человека используется всего лишь несколько десятков этих ферментов. При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины, анализируемый электрофоретически.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов - внутривидовая изменчивость по длине фрагментов геномной ДНК, образующихся после воздействия специфической эндонуклеазой. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованных, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генетического кода могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определённых рестриктаз, делают их устойчивыми к действию этих ферментов.

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами.

Анализ ПДРФ включает следующие основные этапы:

1) выделение геномной ДНК;

2) рестрикция выделенной ДНК специфической эндонуклеазой;

3) электрофоретическое разделение образующихся фрагментов;

4) идентификация.

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путём проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК, размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины.

Секвенирование

Секвенирование – метод определения нуклеотидной последовательности ДНК.

Еще в 50-е годы XX века были разработаны методы секвенирования по аминокислотной последовательности белков-ферментов. Недостатком метода явилось, во-первых, то, что распознаванию поддаются только экзоны, так как интроны в ходе процессинга и сплайсинга «вырезаются» и в трансляции участия не принимают. Во-вторых, вследствие вырожденности генетического кода одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами с различной последовательностью нуклеотидов.

В конце 60-х годов прошлого века Ф. Сэнгером были разработаны методы секвенирования РНК, получаемой с ДНК-матрицы при помощи РНК-полимеразы.

Первым методом прямого ферментативного секвенирования стал «плюс-минус» метод, разработанный в 1975 году Ф.Сэнгером и Д.Коулсоном. Методика заключается в проведении ограниченной полимеразной реакции в присутствии всех четырех dNTP (один из которых маркирован по альфа-положению фосфата). После проведения очистки от невключившихся дезоксинуклеотидов, смесь разделяют на восемь частей и в «плюс»-системе проводят реакцию в присутствии одного из четырех нуклеотидов, а «минус»-системе – в отсутствии одного из них. Полученные фрагменты разделяют в ПААГ и регистрируют результат. Соответственно в «минус»-системе терминация происходит перед dNTP данного типа, а в «плюс»-системе - после него.

В1976 году А.Максамом и У.Гилбертом был разработан метод химической деградации ДНК. Исследуемый образец разделяется на четыре аликвоты и в каждую из них вводится реагент, модифицирующий один из dNTP. Последующее выщепление модифицированных нуклеотидов и разделение полученных фрагментов методом гель-электрофореза позволяет установить нуклеотидную последовательность искомого фрагмента нуклеиновой кислоты.

В 1977 году Ф.Сэнгером и Д.Коулсоном был предложен еще один метод, названный ими методом «терминаторов» («дидезокси-метод»). Методика заключается в проведении полимеразной реакции, в которой помимо матрицы и четырех типов dNTP (один из которых радиоактивно меченый по альфа-положению фосфата) вносится один 2’,3’-дидезоксинуклеотид (ddNTP), который способен встраиваться в растущую цепь, но препятствует дальнейшему росту цепи, вследствие отсутствия 3’-ОН-группы. Соответственно терминация роста цепи наступает после включения в нее ddNTP. Постановка реакции в четырех пробирках с четырьмя разными ddNTP, при разделении в ПААГ позволяет расшифровать последовательность нуклеотидов в ДНК.

В настоящее время широко применяются методы автоматического секвенирования ДНК, основанные на ферментативном секвенировании с использованием терминирующих трансляцию ddNTP. Процесс, как и метод «терминаторов», состоит из двух этапов: проведение терминирующих реакций и разделение полученных фрагментов в полиакриламидном геле. Автоматизированным является только второй этап. Но в отличие от метода Сэнгера-Коулсона, радиоактивно меченый нуклеотид заменен на нуклеотид, несущий флюоресцентную метку. Это значительно удешевляет методику и облегчает процесс детекции результатов.

Несмотря на это, методика анализа достаточно затратна и продолжительна, что не позволяет использовать ее в проведении повседневных анализов и особенно при массовых скрининговых исследованиях.

6.2. Ответить на контрольные вопросы.