Визначання глюкоамілазної активності

Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі розчинного крохмалю ферментом глюкоамілази.

Глюкоамілазна активність (ГлС) характеризує здатність ферментного препарату каталізувати розщеплення розчинного крохмалю до глюкози і виражається числом одиниць активності в 1 г препарату.

За одиницю глюкоамілазної активності прийнято здатність ферменту каталізувати гідроліз розчинного крохмалю за визначених умов температури і рН, звільняючи за 1 хв. 1 мкмоль глюкози.

Прилади та реактиви

-Апаратура і матеріали – за п.1 із наступними доповненнями.

-Колориметр фотоелектричний лабораторний (фотоелектроколориметр) за ГОСТ 12083 або спектрофотометр.

-Калій фосфорнокислий однозаміщений за ГОСТ 4198, розчин молярної концентрації 1 моль/дм³.

-Калій залізистосинеродистий за ГОСТ 4207.

-Глюкоза за ГОСТ 6038.

-Натрій оцтовокислий за ГОСТ 199.

-Кислота оцтова за ГОСТ 61.

-Крохмаль розчинний за ГОСТ 10163.

-Кислота бензойна за ГОСТ 10521.

-Калій гідроксид за ГОСТ 24363, розчин молярної концентрації 1моль/дм³.

-Калій хлористий.

-Спирт етиловий ректифікований за ДСТУ 4221-2003.

-Глюкозооксидаза з ферментативною активністю 100000 од./г.

-Пероксидаза.

-Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Підготовка до визначання

Приготування розчину крохмалю з масовою часткою

1 % (субстрату) – за п.1

Приготування фосфатного буферного розчину з рН 7,5

концентрацією 1 моль/дм³

Змішують рівні об’єми розчинів фосфорнокислого однозаміщеного калію і гідроксиду калію концентрацією 1 моль/дм³.

Величину рН перевіряють на приладі.

Приготування розчину залізистосинеродистого калію з масовою часткою 1 % (розчина А)

0,05 г залізистосинеродистого калію кількісно переносять в мірну колбу місткістю 50 см³ і об’єм доводять дистильованою водою до мітки.

Розчин готують безпосередньо перед Визначанням.

Приготування розчину глюкооксидази (розчина Б)

5,00 (6,00) мг глюкооксидази розчиняють фосфатним буферним розчином з рН 7,5 в мірній колбі місткістю 50 см³ і потім додають 2,0 мг пероксидази. Об’єм доводять до мітки фосфатним буферним розчином.

Якщо активність глюкооксидази відрізняється від необхідної

(100000 од./г), то наважку беруть з таким розрахунком, щоб в 50 см³ розчину містилось 500-600 од. активності.

Приготування робочого розчину С

Робочий розчин С готують змішуванням рівних об’ємів розчинів А і Б.

Одержаний розчин зберігають в темній склянці в холодильнику протягом 2-3 діб.

Приготування насиченого розчину бензойної кислоти

2,7 г бензойної кислоти кількісно переносять в мірну колбу місткістю 1000 см³ і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування стандартних розчинів глюкози

Для приготування стандартних розчинів глюкози користуються перекристалізованою із спирту зневодненою глюкозою, яку зберігають в ексикаторі над хлористим кальцієм.

100,00 мг глюкози розчиняють в 100 см³ насиченого розчину бензойної кислоти. Із цього розчину відбирають почергово 5, 10 і 15 см³ в мірній колбі місткістю 100 см³ і доводять об’єм до мітки бензойної кислоти. Отримані розчини відповідають вмісту 50, 100 і 150 мкг глюкози в 1 см³.

Ці розчини використовують для побудови градуювального графіка.