Приготування основного і робочого розчинів очищених ферментних препаратів готують за п.1

Робочий розчин готують із основного розчину, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності препарату.

Приготування основного і робочого розчинів із повітряно-сухої культури гриба

1,00-5,00 г дослідної повітряно-сухої культури гриба (в залежності від активності) попередньо розтертої в ступці, переносять в конічну колбу місткістю 250 см³, додають 100 см³ дистильованої води, суміш витримують при кімнатній температурі протягом 1 год, періодично перемішуючи, а потім фільтрують.

Основний розчин зберігають потягом доби при температурі від 2 до 6°С.

Робочий розчин готують із основного, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності.

Приготування робочого розчину із культуральної рідини

Відфільтровану культуральну рідину розбавляють дистильованою водою в 1000 і більше разів в залежності від передбаченої активності.

Побудова градуювального графіка

В пробірки приливають по 1 см³ стандартних розчинів глюкози, додають по 3 см³ робочого розчину С. В контрольну пробу (контроль на реактив С) замість глюкози доливають 1 см³ дистильованої води. Залишають пробірки на 45 хв. при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Потім виміряють інтенсивність забарвлення розчину глюкози в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм проти контрольної проби з реактиву С.

За отриманими значеннями будують градуювальний графік, що має лінійну залежність.

Робоча зона градуювального графіка лежить в області 50-150 мкг.

Оптична густина розчину повинна бути близькою до значень 0,1±0,01; 0,2±0,01; 0,3±0,01.

Якщо оптична густина відрізняється від цих значень, то наважку глюкооксидази збільшують.

Проведення визначання

Беруть дві паралельні наважки досліджуваного продукту і з кожної роблять не менше двох розведень. Кожне розведення досліджуваного розчину аналізують не менше двох разів.

В пробірку наливають 10 см³ розчину крохмалю (субстрату) і ставлять в термостат або водяну баню з температурою (30,0±0,2)°С на 5-10 хв. Потім доливають до вмісту пробірки 5 см³ розчину досліджуваного продукту і інкубують суміш на протязі 10 хв при тій же температурі.

Потім 1 см³ суміші переносять в другу пробірку, що знаходиться в киплячій бані, витримують протягом 2 хв (для інактивації ферменту) і охолоджують холодною водою. Потім до суміші додають 3 см³ розчину С, перемішують і залишають на 45 хв при кімнатній температурі.

Одночасно готують контрольну пробу. Для цього 5 см³ розчину досліджуваного продукту витримують в киплячій водяній бані протягом

10 хв (для інактивації ферменту). Потім розчин охолоджують і додають 10 см³ розчину крохмалю.

Всі наступні операції з контрольними пробами проводять також, як і з дослідними.

Крім вказаної контрольної проби на інактивований фермент ставлять контрольну пробу на робочий розчин С. Для цього до 3 см³ розчину приливають 1 см³ дистильованої води.

Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм.

Якщо контрольні проби на інактивований фермент мають забарвлення, то необхідно досліджуваний розчин проколориметрувати, взявши в якості розчину порівняння робочий розчин.

Значення оптичної густини повинно знаходитись в межах відповідних масі глюкози від 50 до 150 мкг.