33. Лабораторні методи діагностики протозоозів.

Лабораторні методи виявлення протозоїв за життя тварин.

Для виявлення збудників бабезіозів, анаплазмозу (локалізуються в еритроцитах), бореліозу птахів (у плазмі крові) готують тонкий мазок крові.

Одноклітинні організми, які паразитують у травному каналі (еймерії, ізоспори, криптоспоридії, токсоплазми, саркоцисти), виявляють флотаційними методами Фюллеборна чи Дарлінга, в польових умовах – методом нативного мазка.

За підозри на трихоманоз, парувальну хворобу коней, гістомоноз птахів та балантидіоз свиней досліджують різні біологічні субстрати (витоки, змивання із статевих органів, сперму самців, фекалії, кров, тощо) методом роздавленої краплі, з метою виявлення

рухливих об’єктів.

Успішність лабораторної діагностики кровопаразитарних хвороб значно залежить від якості приготування і фарбування мазків. Техніка їх приготування включає підготовку предметних скелець, виготовлення мазків, фіксацію та їх фарбування.

Підготовка предметних скелець. Для отримання тонкого мазка крові потрібні чисті, знежирені, без слідів кислот та лугів предметні скельця.

Для цього їх миють та кип’ятять у воді з мийними засобами (мило, пральний порошок) 3–5 хвилин (якщо скельця не були в експлуатації), або 1 годину в 5–10% розчині солі, якщо скельця використовувались для виготовлення мазків. Потім їх ретельно промивають у чистій воді, насухо витирають рушником. Зберігають готові скельця у банці із притертим корком у 96◦ С етиловому спирті чи у суміші його з ефіром (1:1).

Виготовлення тонкого мазка крові, лімфи. Кров у свійських тварин у більшості випадків використовують із периферичних судин вушної раковини чи кінчика хвоста, у птиці – з гребеня, сережок чи підкрильцевої вени. Для цього тварин надійно фіксують, належним чином підготовлюють місце проколу і стерильно отримують потрібну кількість крові. Слід використовувати перші краплі крові, у яких кількість

паразитів найбільша. Утримуючи великим і вказівним пальцями лівої руки предметне скло, обережно торкаються ним поверхні краплини крові, що виступає, наносять кров в об’ємі до просяної зернини на відстані 3–5 мм від краю скла. Потім, утримуючи великим і вказівним пальцями правої руки шліфоване скло, ставлять його вузьким ребром попереду краплі під кутом 45◦ до неї і змішують до зіткнення з нею. Кількома

поперечними рухами краплю рівномірно розмішують уздовж ребра скельця. Потім рівномірним, без натискання рухом змішують шліфоване скельце справа-наліво, кров має розподілитись рівномірним тонким шаром.

Вважається, що на бічних сторонах мазка і борідці розміщується основна частина уражених паразитами еритроцитів.

Отримані мазки висушують на повітрі чи краще під скляним ковпаком, з метою зaxиcтy від мух та прямих сонячних променів, у холодну пору – від дії на них парів вологи, які спричинюють гемоліз еритроцитів. Від кожної тварини готують 3–4 мазки. Після висушування їх підписують простим олівцем чи голкою на початку мазка, вказуючи вид тварини, кличку та дату виготовлення мазка.

Фіксація тонкого мазка. Висушені мазки зберігаються обмежений час, тому їх фіксують у чистому метиловому (5 хв) чи етиловому (15–20 хв) спиртах (90–95о) або в суміші (1:1) спирт-ефіру (10–15 хв), в денатураті (30 хв) чи в ацетоні (5 хв). Занурюють у фіксатор під кутом до стінки посуду по два скельця, які стикаються між собою вільними від мазків поверхнями.

Фарбування тонкого мазка зa методом Романовського.

Офіцинальний розчин фарби Гімза, виготовлений фабрично є концентрованим. Під час приготування робочого розчину, фарбу розчиняють із розрахунку 1–3 краплі на 1 мл води. Останній готують безпосередньо перед застосуванням. Воду для цього використовуюсь дистильовану, кип’ячену, профільтровану снігову, дощову, але

обов’язково з рН нейтральної (7,0), чи слаболужної реакції (7,2). Робочий розчин готують завжди в одному і тому самому чистому посуді, із розрахунку 5 мл на предметне скельце. Розчин фарби підшаровують під скло з мазком, розташованим знизу, завдяки цьому на його поверхні не залишається частинок фарби, яка випала в осад під час приготування. Фарбування триває 40–60 (20–120) хвилин. Після закінчення фарбування з препаратів проточною водою обережно змивають фарбу і висушують на повітрі. Досліджують їх під імерсійною системою мікроскопа. Правильно пофарбовані мазки мають бузковий колір, іноді із слабким фіолетовим відтінком. Еритроцити забарвлюються у рожевий колір, цитоплазма лімфоцитів – у синій, а їхні ядра у темно-фіолетовий. Цитоплазма одноклітинних організмів набуває блакитного, а ядра – темно-червоного або червоного кольору. Мазки червоного та темно-фіолетового кольору не придатні для діагностики.

Приготування товстої краплі. Одну або дві краплі крові із периферичних судин або яремної вени наносять на знежирене предметне скло і круговими рухами скляної палички розмішують її товстим шаром діаметром 10-копійкової монети. Потім висушують її під скляним ковпаком чи в термостаті.

Фарбування товстої краплі. На нефіксований мазок крові наносять фарбу, до складу якої входить: 1% розчин метиленової синьки – 4 частини, 1% розчин фуксину на 50% розчині спирту – 1 частина, 1% розчин оцтової кислоти – 4 частини та 40 частин дистильованої води.

Фарбують протягом 15 хвилин. Потім фарбу обережно змивають водою і висушують мазок на повітрі. За такої методики еритроцити розчиняються, а зоопаразити залишаються і при цьому їх органоїди фарбуються диференційовано.

Приготування роздавленої краплі. Цим методом користуються для виявлення найпростіших, які здатні рухатися (трихомонади, гістомонади, трипаносоми, балантидії). Під час діагностування трансмісивного трипаносомозу у коней беруть краплю крові від досліджуваної тварини, наносять на чисте предметне скло і накривають накривним скельцем.

Крапля крові повинна розміщуватися тонким рівним шаром і не виходити за межі накривного скельця. Подібним чином готують роздавлену краплю під час діагностування трихомонозу великої рогатої худоби, але об’єктом для дослідження є: у корів – виділення із статевих шляхів, навколозародкова рідина, вміст шлунку та інших порожнин абортованого зародка; у биків – змиви секрету міхурцеподібних залоз, з препуція та сперма, а також крапля культури, на якій вирощували трихомонад. Під час дослідження краї накривного скельця доцільно обвести вазеліном, щоб запобігти випаровуванню рідини і висиханню досліджуваного об’єкта. Роздавлену краплю досліджують без фарбування, під сухою системою мікроскопа, в затемненому полі та за середнього збільшення. У разі парувального трипаносомозу досліджують зскріби із статевих органів і досліджують також методом роздавленої краплі.

Дослідження пунктату із лімфатичних вузлів. Цю методику застосовують за підозри на тейлеріоз у великої рогатої худоби. Для пункції використовують розташовані поверхнево, запалені лімфовузли, частіше передлопаткові. Операційне поле спочатку вистригають і дезинфікують, після фіксації пальцями в глибину вузла вводять стерильну голку, надіту на шприц. Поршень шприца ледь відтягують і повільно відсмоктують у голку лімфу. З отриманого пунктату готують тонкі мазки,

висушують їх, фіксують, фарбують фарбою Гімза за Романовським і досліджують під імерсійною системою мікроскопа.