Биохимия ферменТов

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Синтезируются в клетках организма. Каталитические свойства ферментов связаны с их способностью специфически активировать химические реакции.

Работа, которую выполняют ферменты в качестве биологических катализаторов, необычайно эффективна. В некоторых случаях реакции под действием ферментов протекают более чем в миллион раз быстрее нежели в их отсутствие.

Высокая каталитическая активность ферментов связана с тем, что они временно соединяются с субстратами, образуя фермент-субстратные комплексы.

Ферменты могут быть как простыми (состоят только из аминокислот), так и сложными, т.е. в своем составе имеют небелковый компонент – кофермент. Коферментами могут быть ионы металлов, нуклеотиды, производные нуклеотидов и др.

Лабораторная работа №6 Количественное определение активности амилазы (по Вольгемуту)

Для знакомства со свойствами ферментов используют в качестве объектов α-амилазу слюны. Она катализирует гидролиз крахмала и гликогена и является эндополиглюкозидазой, разрушающей α-1,4-гликозидные связи в молекуле этих полисахаридов. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные соединения (декстрины) до мальтозы Источником амилазы может быть слюна, содержащая α-амилазу. Гидролиз крахмала α-амилазой происходит через ряд стадий. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера их молекулы: амилодекстрины – фиолетовое; эритродекстрины – красное; арходекстрины и мальтоза – бесцветное (желтое окрашивание раствора связано с окраской самого раствора йода).

Этим методом определяют активность амилазы в слюне, в сыворотке крови, в моче.

Принцип метода. Метод заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала, находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество крахмала, затем производят пересчет на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны выражается в количестве 0,1% раствора крахмала, которое гидролизуется 1 мл неразбавленной слюны при t = 38°C в течение 30 мин. В норме амилазная активность слюны .

Исследуемый материал и реактивы

1. Слюна в разведении 1:20. 2. Раствор крахмала (0,1%). 3. Раствор 0,1% йода в 0,2% йодистом калии.

Ход работы

Приготовить разведение слюны в 20 раз. Для этого в мерный цилиндр собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивается водой) и доводят водой до метки 20 мл.

Одновременно готовят ряд растворов с возрастающим разведением слюны. Для этой цели берут 11 пробирок, в которые за исключением пробирки №1 наливают по 1 мл дистиллированной воды. В пробирки №1 и №2 разливают по 1 мл слюны. После перемешивания жидкости из пробирки №2 отбирают 1 мл и вносят его в пробирку №3. Повторяют ту же операцию с жидкостью в пробирке №3 и т.д. В результате получают ряд с возрастающим разведением слюны.

Затем в каждую из пробирок наливают по 2 мл 0,1%раствора крахмала и все содержимое пробирки перемешивают, ставят на 30 мин в водяную баню при температуре 38°С. После этого добавляют по несколько капель реактива Люголя (раствор J₂ в KJ) в каждую пробирку и перемешивают. Жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. В розовый – благодаря наличию декстринов, а в фиолетовый – благодаря присутствию нерасщепившегося крахмала.

Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской. Если слюна в ней, например, была разведена в 320 раз, составляют следующую пропорцию и находят амилокластическую силу слюны:

1/320 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала

1 мл слюны расщепил Х мл 0,1 % раствора крахмала

0,1% раствора крахмала.