Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют и к какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2. Почему АлАТ и АсАТ называют индикаторными ферментами?

3. Назовите нормальные величины активности исследованных Вами ферментов?

Лабораторная работа №23 Определение мочевины в крови по реакции с диацетилмонооксимом (набором реагентов)

Одним из главных продуктов азотистого обмена в организме является мочевина. Синтезируется она в печени, оттуда поступает в кровь и выделяется с мочой. Мочевина составляет около 50% остаточного азота крови. В норме в сыворотке крови содержание мочевины колеблется от 2,5-8,3 ммоль/л. У детей от 1 года до 14 лет – 1,63-6,64 ммоль/л. С мочой взрослого человека за сутки выводится 20-35г, а в возрасте от 1 года до 14 лет – 4,0-16,0г мочевины.

В клинической лабораторной практике определение мочевины необходимо для оценки белкового обмена; своевременной диагностики и лечения врожденных нарушений орнитинового цикла реакций синтеза мочевины; помощи в оценке работы выделительной функции почек, степени почечной и печеночной недостаточности.

Повышение концентрации мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором.

Пониженное содержание мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (дистрофия печени, цирроз, паренхиматозная желтуха), что связано с нарушением её мочевинообразовательной функции; при нефрите, ацидозе, уремии.

Принцип метода. В кислой среде в присутсвии тисемикарбазида и ионов трехвалентного железа мочевина образует с диацетилмонооксимом комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при 510нм пропорциональна концентрации мочевины.

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка (плазма) крови без гемолиза. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Реакционная смесь сухая (4 пробирки). 6. Раствор соли железа трехвалентного (5 ммоль/л). 7. Калибровочный раствор мочевины (8 ммоль/л). 8. Кислота серная, концентрированная (96%), х.ч. 9. Кислота трихлоруксусная, ч

Ход работы

А. Приготовление раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают около 300 мл дистиллированной воды и при постоянном помешивании добавляют 50 мл серной кислоты. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив.

Б. Приготовление раствора реакционной смеси. В мерную колбу вместимостью 100 мл количественно переносят содержимое пробирки сухой реакционной смеси и растворяют его примерно в 60 мл дистиллированной воды при нагревании 40-50⁰С. После охлаждения добавляют 1 мл раствора соли железа трехвалентного и доливают водой до метки. Раствор стабилен при комнатной температуре в течение 2 недель. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешает определению.

В. Приготовление рабочего раствора. Приготовляют смешением 1 доли раствора реакционной смеси с 1 долей раствора серной кислоты. Ежедневно готовят свежий рабочий раствор.

Г. Приготовление раствора ТХУ 50 г/л (для депротеинирования). 10г ТХУ растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив.

Д. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (без депротеинирования). Образцы: сыворотка (плазма) крови. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

	Холостая проба, мл	Калибровочная проба, мл (DК )	Опытная проба, мл (D0)
Сыворотка (плазма) крови	–	–	0,01
Калибровочный раствор мочевины	–	0,01	–
Рабочий раствор	2,00	2,00	2,00

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстия закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510нм (490-540нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут.

Е. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (с депротеинированием). Образцы: сыворотка (плазма) крови липимическая или гемолизированная, цельная кровь.

В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

	Холостая проба, мл	Калибровочная проба, мл (DК )	Опытная проба, мл (D0)
Раствор ТХУ	0,1	0,5	0,5
Сыворотка (плазма) крови	–	–	0,05
Калибровочный раствор мочевины	–	0,05	–
Перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочная жидкость	–	0,1	0,1
Рабочий раствор	2,0	2,0	2,0

Далее проводят определение, как при анализе без депротеинирования.

Содержания мочевины производят по формуле:

,

где: С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л; D₀ – оптическая плотность опытной пробы; D_К – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,0 – содержание мочевины в калибровочном раствора, ммоль/л.

Примечания: при содержании мочевины в крови свыше 17 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой и анализ провести повторно. Результат умножить на разведение.

При использовании кюветы другого объема расход реактивов может быть пропорционально изменен при сохранении соотношения проба/рабочий раствор 1:100.