Ход работы

Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-8⁰С.

Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре.

А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0,25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 37⁰С в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови, инкубируют при 37⁰С 60 минут. Затем добавляют 0,25 мл 2,4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2,5 мл 0,4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы.

Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-25⁰С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.

№ п/п	Стандартный р-р пирувата натрия	Физиологич. раствор	Субстратный раствор АлАТ/АсАТ	Активность фермента (АсАТ, АлАТ)
	мл	мл	мл	ммоль/(ч*л)	мккат/л
1	0,05	0,1	0,45	1,0	0,28
2	0,1	0,1	0,40	2,0	0,56
3	0,15	0,1	0,35	3,0	0,83
4	0,2	0,1	0,30	4,0	1,11
5	0,25	0,1	0,25	5,0	1,39
контроль	–	0,1	0,50

Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»).

Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.