Биохимия нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК – представляют собой линейные биологические полимеры, построенные из мононуклеотидов, соединенных 3΄5΄-фосфодиэфирными связями. Последние состоят из гидрофобных циклических структур - азотистых оснований (пуриновых и пиримидиновых), гидрофильной части, представленной пентозами (рибозой или дезоксирибозой) и остатками фосфорной кислоты. Остатки фосфорной кислоты соединяют два смежных мононуклеотида при помощи 3΄5΄-фосфодиэфирной связи.

Нуклеиновые кислоты находятся в клетке в составе нуклеопротеинов.

Биологическая роль нуклеиновых кислот огромна. Они принимают участие в передаче наследственной информации и в биосинтезе белка, являясь структурными элементами ядра и цитоплазмы.

Лабораторная работа №11 Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение состава нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты являются небелковой частью нуклеопротеинов. Нуклеопротеины – это сложные белки, белковой частью которых являются в основном протамины или гистоны, которые обладают щелочными свойствами, за счет большого количества входящих в них диаминокарбоновых кислот (аргинин, лизин и гистидин).

Нуклеопротеины могут быть легко выделены из тканей, содержащих большое количество ядер, например из зобной, панкреатической железы, селезенки, печени, почек и др. Особенно богаты нуклеопротеинами дрожжи, бактерии, простейшие, грибы, одноклеточные водоросли. Вирусы почти полностью построены из нуклеопротеинов.

Биологическая роль нуклеиновых кислот огромна. Они принимают участие в передаче наследственной информации и в биосинтезе белка, являясь структурными элементами ядра и протоплазмы. Производные моно- (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ, ДТФ, ФМН, КоА и др.) и динуклеотидов (НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД и др.) также выполняют в организме важные функции.

Принцип метода. Определить состав нуклеиновых кислот удается с помощью кислотного гидролиза нуклеопротеинов клеток, например, дрожжей, в присутствии серной кислоты. При кислотном гидролизе нуклеопротеины вначале распадаются на белок и нуклеиновые кислоты, а затем при продолжительном гидролизе наступает их полный распад на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу, дезоксирибозу и фосфорную кислоту, которые могут быть обнаружены специфическими реакциями.

Исследуемый материал и реактивы

1. Дрожжи (сухие). 2. Песок (щепотка). 3. Эфир. 4. Раствор NaOH (0,4%), (10%). 5. Раствор уксусной кислоты (1%). 6. Раствор Н₂SО₄ (10%). 7. Раствор СuSO₄ (1%). 8. Раствор NH₄OH (концентрированный). 9. Раствор AgNО₃ (1%). 10. Спиртовой раствор α-нафтола. 11. Раствор H₂SO₄ (концентрированный). 12. Молибденовый реактив. 13. Фильтровальная бумага.

Ход работы

Одним из источников для выделения нуклеопротеидов являются дрожжи. Для этой цели 10 г дрожжей растирают в ступке со щепоткой песка, 0,5 мл эфира, добавляют 20 мл 0,4% раствора NaOH и продолжают растирание в течение 15 мин. После этого разливают содержимое ступки в центрифужные пробирки, уравновешивают их и центрифугируют в течение 5-10 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в стакан и при постоянном помешивании добавляют раствор уксусной кислоты (1%) в количестве 15-20 мл для осаждения нуклеопротеида. Выпавший осадок РНК-протеина отделяют путем центрифугирования и выделенный нуклеопротеид гидролизуют.

А. Гидролиз нуклеопротеина. Полученный осадок переносят в коническую колбу, добавляют к нему 10 мл 10% раствора Н₂SО₄ и закрывают пробкой со вставленной в нее стеклянной трубкой 20-30 мл длинной (воздушный холодильник). Колбу помещают в водяную баню и нагревают в кипящей водяной бане 1 час. После этого охлаждают колбу до комнатной температуры и фильтруют. В фильтрате определяют продукты гидролиза.

Б. Биуретовая реакция на пептиды. К 5-6 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10% раствора NаОН и 1 каплю 1% -го раствора СuSO₄. При наличии белка жидкость приобретает характерную сине-фиолетовую окраску.

В. Проба на пуриновые основания. 0,5 мл гидролизата нейтрализуют 1-2 каплями концентрированного раствора NH₄OH и добавляют 5 капель 1% раствора AgNО₃. Через несколько минут образуется рыхлый осадок соединений пуриновых оснований с серебром, окрашенный в бурый цвет.

Г. Качественная реакция на углеводный компонент. (Реакция Подобедова-Молиша). К 0,5 мл гидролизата добавляют 1 -2 капли спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и осторожно наслаивают 0,5 мл концентрированной H₂SO₄. На границе раздела жидкостей появляется фиолетовое кольцо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в нуклеопротеидах.

Д. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 0,5 мл молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят смесь на пламени горелки. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонный цвет. После охлаждения в струе воды наблюдают появление желтого кристаллического осадка - фосфомолибдата аммония,