Тема 12. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилювання. Інгібітори і роз’єднувачі окисного фосфорилювання.

Актуальність теми.

Мітохондріальну систему спряження окисних процесів з генерацією високоенергетичного інтермедіату АТФ, називають окисним фосфорилюванням.

Окисне фосфорилювання дозволяє організму поглинати значну частку потенційно вільної енергії окислення субстратів. Обґрунтування механізму окисного фосфорилювання дозволяє зробити хеміосмотична теорія. Окисне фосфорилювання є дуже важливим процесом, порушення перебігання його несумісно з життям.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Вивчити хеміосмотичну теорію окисного фосфорилювання та умови його ефективного перебігу.

Конкретні цілі:

1. Трактувати роль біохімічного окислення, тканинного дихання та окисного фосфорилювання в генерації АТФ за аеробних умов.

2. Аналізувати порушення синтезу АТФ за умов дії на організм людини патогенних факторів хімічного, фізичного та біологічного походження.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати особливості гістологічної будови мітохондрій та основи біоенергетики тканин.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне вивчення процесу окисного фосфорилювання в мітохондріях.	1.1. Дослідити процес окисного фосфорилювання в мітохондріях, пояснити, на чому він базується.
2. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилювання – молекулярний механізм генерації АТФ в процесі біологічного окислення.	2.1. Електрохімічний градієнт протонів (ΔμН+). Фізико-хімічні складові електрохімічного градієнту протонів.
3. Умови ефективного спряження окислення та фосфорилювання в мітохондріях.	3.1. Цілісність мітохондріальної мембрани. 3.2. Наявність всіх компонентів ланцюга транспорту. 3.3. Специфічна внутрішньомембранна топографія переносників. 3.4. Наявність достатньої кількості АДФ та Рі.
4. Інгібітори та роз’єднувачі тканинного дихання.	4.1. Інгібітори транспорту електронів (ротинон, амітал, ціаніди, СО). 4.2. Роз’єднувачі окисного фосфорилювання (2,4-динітрофенол, гормони щитовидної залози, вільні жирні кислоти). 4.3. Порушення синтезу АТФ в умовах дії на організм людини патогенних факторів хімічного, фізичного та біологічного походження.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Огляд наукової літератури та підготовка реферативних повідомлень за темами:

1. Роз’єднувачі окисного фосфорилювання і регуляція термогенезу.

2. Універсальність хеміосмотичної теорії для живих систем.

Алгоритм лабораторної роботи.

Вивчення окисного фосфорилювання в мітохондріях та дії

роз’єднувача – 2,4-динітрофенолу на цей процес.

Принцип методу. В процесі окислення різних субстратів і передачі електронів в дихальному ланцюгу мітохондрій вивільняється енергія. Частина цієї енергії використовується для синтезу АТФ в процесі окисного фосфорилювання:

АДФ + Ф_н  АТФ

В експерименті, щоб запобігти нагромадженню АТФ (високий вміст АТФ інгібує ферменти дихального ланцюга) в якості кінцевого акцептора неорганічного фосфату використовують глюкозу. Фосфорилювання глюкози за участю АТФ каталізує фермент – гексокіназа:

Глюкоза + АТФ  АДФ + глюкозо-6-фосфат

Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності молібдату амонію в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням фосфату амонію. Фосфат амонію під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює продукти забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилювання Ф_н вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Роз’єднувачі – це сполуки які порушують спряженість окислення і фосфорилювання в мітохондріях. В присутності роз’єднувачів спостерігається активне поглинання кисню мітохондріями, однак швидкість генерації АТФ – значно зменшується (або відсутня). Згідно з хеміосмотичною теорією, роз’єднувачі спричиняють втрату мембраною електрохімічного протонного потенціалу – рушійної сили генерації макроергічних зв’язків АТФ.

Матеріали і реактиви: свіжовиділені мітохондрії з м’язів кроля; суміш № 1 – 0,08 моль КН₂РО₄, 0,255 моль KCl, 0,05 моль MgCl₂ розчиняють в дистильованій воді, додають 0,1 М розчин КОН до рН = 7,4 та доводять об’єм в мірній колбі до 1 л; суміш № 2 – водний розчин глюкози з АТФ, що містить 90 мг глюкози та 30 мг АТФ в 1 мл; гексокіназа в 1%-му розчині глюкози (0,8 мг гексокінази в 1 мл); 5%-й розчин сукцинату калію; 5%-й розчин оцтової кислоти; 10%-й розчин три хлороцтової кислоти (ТХО); 1 %-й розчин динітрофенолу; 2,5%-й розчин молібдата амонію в 10 М розчині H₂SO₄ (2,5 г молібдата амонію розчиняють в 50 мл 20 М розчину H₂SO₄ і доводять об’єм водою до 100 мл); 5%-й розчин аскорбінової кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
	Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Суміш № 1	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Суміш № 2	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Гексокіназа	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Сукцинат калію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
2,4-динітнофенол (краплі)	---	---	2 краплі
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Розчин оцтової кислоти (краплі)	2 краплі	---	---
Інкубація в термостаті 15 хв. при температурі 37^оС
Розчин ТХО	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Молібдат амонію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Аскорбінова кислота	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Результати: спостерігають за появою синього забарвлення

Оцтова кислота додається для повноти денатурації білка в контрольній пробірці. Після інкубації в термостаті протягом 15 хв. при 37^оС в кожну пробірку додають по 1,0 мл 10%-го розчину ТХО; по 0,5 мл 2,5%-го розчину молубдата амонію та по 0,5 мл 5%-го розчину аскорбінової кислоти. Протягом 20 хвилин спостерігають за появою синього забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.