Тема 2. Дослідження будови і фізико-хімічних властивостей білків-ферментів

Актуальність теми.

Ферменти це біологічні каталізатори реакцій обміну речовин. Білкова природа ферментів обумовлює їх високу лабільність в залежності від багатьох факторів. Так, в залежності від температури тіла людини, а також від рН внутрішнього середовища організму активність ферментів може змінюватись, що призводить до розвитку патологічних процесів.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Вивчити фізико-хімічні властивості білків-ферментів.

Конкретні цілі:

1. Аналізувати механізми регуляції основних метаболічних процесів;

2. Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів;

3. Аналізувати фізико-хімічні властивості білків-ферментів.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати будову білків, класифікацію та структуру протеїногенних амінокислот.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне вивчення фізико-хімічних властивостей білків-ферментів.	1.1. Довести білкову природу ферментів біуретовою реакцією, реакцією Фоля. Пояснити принципи методу. 1.2. Пояснити термолабільність ферментів на прикладі визначення активності амілази слини, яка попередньо нагріта або охолоджена та попередньо не оброблена. 1.3. Вивчити залежність ферменту слини амілази від рН середовища.
2. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин.	2.1. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів. 2.2. Електрохімічні властивості, розчинність. 2.3. Термодинамічна стабільність білкових молекул ферментів; денатурація.
3. Будова ферментних білків. Прості і складні ферменти.	3.1. Апофермент, кофермент (простетична група). Олігомерні білки-ферменти, мультиензимні комплекси. 3.2. Мембранно-асоційовані ферменти.
4. Методи виділення ферментів з біооб’єктів.	4.1. Ультрацентрифугування. 4.2. Гель- та іонообмінна хроматографія. 4.3. Електрофорез.

Алгоритм лабораторної роботи.

1. Довести білкову природу ферментів біуретовою реакцією, реакцією Фоля.

1.1. Біуретова реакція на білки:

Принцип реакції: іони міді (Cu²⁺) у лужному середовищі утворюють з пептидними групами комплексну сполуку синьо-фіолетового кольору.

Хід роботи: у пробірку налити 0,5 мл досліджуваного розчину та 0,5 мл біуретового реактиву. Розвиваєть синьо-фіолетове забарвлення.

1.2. Реакція Фоля.

Принцип методу: при нагріванні розчину білку, в якому є залишки сірковмісних амінокислот (цистеїн) з розчинами лугу та солі свинцю, сірка утворює чорний осад PbS.

Хід роботи: у пробірку налити 0,5 мл досліджуваного розчину, додати 1 мл реактиву Фоля. Нагрівати на водяній бані до утворення чорного осаду.

2. Вивчення термолабільності ферментів.

Слину розвести у 5 разів (1 мл слини + 4 мл води). 2 мл розведеної слини кип’ятити 5 хвилин. У 3 пробірки налити по 10 кап. 1% розчину крохмалю. У першу пробірку додати 10 кап. води (контроль), у другу – 10 кап. охолодженої прокип’яченої слини, у третю – 10 кап. розведеної слини.

Усі пробірки помістити у водяну баню або термостат при температурі 38 ⁰С на 10 хвилин. Після цього виконати якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу (глюкозу та мальтозу).

Реакція на крохмаль: до 5 кап. досліджуваного розчину додати 1 кап. розчину Люголю (КІ₃). В присутності крохмалю з’являється синє забарвлення.

Реакція Фелінга: до 5 кап. досліджуваного розчину додати 3 кап. розчину Фелінга (CuSO₄ + NaOH), підігріти. В присутності глюкози чи мальтози випадає жовтий осад гідрату закису міді або червоний осад закису міді.

3. Вивчення залежності активності ферментів від рН середовища.

Слину розвести у 10 разів (1 мл слини + 9 мл води). В 3 пробірки налити по 1 мл буферних розчинів з рН 3; 7,4; 14. В кожну пробірку відміряти по 1 мл розведеної слини, по 1 мл 1% розчину крохмалю, перемішати та інкубувати 10 хв. при температурі 38 ⁰ С. Після цього під контролем індикаторного паперу нейтралізувати вміст пробірки з рН 3 - розчином лугу, а вміст пробірки з рН 14 – розчином 0,1н HCl.

Результат досліду виявити за допомогою розчину Люголя, додаючи його по 1-2 кап. в кожну пробірку, розмішати, відмітити забарвлення і зробити висновки.