Тема 4. Дослідження механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу.

Актуальність теми.

Складна будова та функціональна організація ферментів частково є ключем до розуміння характерних властивостей ферментів – високої специфічності та швидкості каталізу. Велику роль у розвитку уявлень про механізм дії ферментів відіграли класичні роботи Міхаеліса і Ментен, які розробили положення про фермент-субстратні комплекси.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Вивчення механізмів дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу. Знати методи визначення активності ферментів, а також вміти інтерпретувати ці методи.

Конкретні цілі:

1. Аналізувати механізми дії ферментів.

2. Пояснити методи визначення активності ферментів

3. Пояснити кінетику ферментативного каталізу.

Вихідний рівень знань-вмінь. Знати біологічну роль та структуру ферментів, фізико-хімічні властивості білків.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне вивчення визначення активності холінестерази.	1.1. Визначення активності холінестерази.
2. Механізми дії ферментів.	2.1. Термодинамічні закономірності ферментативного каталізу. Активні центри ферментів. Відмінності будови активних центрів у простих та складних ферментів. Ферментативне перетворення субстратів за каталітичної дії ферменту на прикладі дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази. Послідовність етапів каталітичного процесу.
3. Кінетика ферментативних реакцій.	3.1. Залежність швидкості реакцій від концентрації ферменту, субстрату, рН та температури. 3.2. Константа Міхаеліса-Ментен, її смислове значення.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Підготувати реферати з розділу «Механізм дії ферментів»:

А) механізм дії антиметаболітів на обмін речовин та їх клінічне застосування;

В) механізм дії ферментів у вогнищі запалення.

Алгоритм лабораторної роботи.

Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Метод виявлення та кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5 мл сироватки крові № 1, у другу – 0,5 мл сироватки крові № 2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними сироватками додають по 2 мл 2% -го розчину ацетилхоліну та інкубують при 37^оС 10 хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1 М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення.

Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Заповнюють таблицю:

Досліджувана сироватка	Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування, в мл	Висновок
№ 1
№ 2

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.