Тема 12. Дослідження перетворень амiнокислот (тpансамiнування, дезамiнування, декаpбоксилювання)

Актуальність теми.

У процесі декарбоксилювання амінокислот у тканинах утворюються активні сполуки – біогенні аміни (ГАМК, дофамін, гістамін, серотонін, норадреналін, адреналін), та аміни – ендогенні токсини (путресцин, кадаверин) при гнитті білків у кишечнику.

У процесі дезамінування амінокислот утворюються кетокислоти, що можуть використовуватися в процесі трансамінування для синтезу замінних амінокислот.

Аланінамінотрансфераза (АлАТ) є гепатоспецифічним ферментом, тому при захворюваннях печінки цей фермент виходить із пошкодженого органу в кров, тому активність АлАТ у сироватці крові підвищується.

Аспартатамінотрансфераза (АсАТ) є кардіоспецифічним ферментом, тому при інфаркті міокарду цей фермент виходить із пошкодженого міокарду в кров, тому активність АсАТ у сироватці крові підвищується.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

1. Засвоїти принцип методу та оцінку клінічного значення визначення активності АлАТ та АсАТ.

2. Відтворити в експерименті процес переамінування з використанням глутамінової та піровиноградної кислот.

Конкретні цілі:

1. Трактувати біохімічні закономірності внутрішньоклітинного метаболізму амінокислот: процеси тpансамiнування, дезамiнування, декаpбоксилювання, пояснювати біологічну дію утворюваних біогенних амінів: серотоніну, гістаміну, гамма-аміномасляної кислоти, тощо.

2. Написати рівняння реакції переамінування глутамінової та піровиноградної кислот.

Вихідний рівень знань-вмінь: вміти писати формули 20 амінокислот. Застосовувати метод хроматографії для виявлення амінокислот.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне вивчення визначення активності амінотрансфераз в сироватці крові.	1.1. Визначення активності амінотрансфераз в сироватці крові.
2. Пул вільних амінокислот в організмі.	2.1. Шляхи надходження вільних амінокислот у тканини. 2.2. Шляхи використання вільних амінокислот у тканинах.
3. Загальні шляхи перетворення амінокислот.	3.1. Трансамінування амінокислот: реакції та їх біохімічне значення. 3.2. Написати рівняння реакцій переамінування глутамінової та піровиноградної кислот. 3.3. Механізм дії амінотрансфераз. 3.4. Пряме та непряме дезамінування вільних L-амінокислот у тканинах. 3.5. Декарбоксилювання L-амінокислот в організмі людини. Фізіологічне значення утворених продуктів. 3.6. Окислення біогенних амінів.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1. Будувати схеми та писати біохімічні (ферментні) реакції перетворення амінокислот в метаболічних процесах дезамінування, трансамінування та декарбоксилування.

2. Аналізувати і трактувати молекулярні механізми регуляції обміну амінокислот та окремих метаболічних шляхів.

3. Підготувати реферативне повідомлення: ”Клінічне значення визначення амінотрансфераз”.

Алгоритм лабораторної роботи.

1. Відтворити в експерименті процес трансамінування використовуючи глутамінову та піровиноградну кислоту.

Принцип методу: полягає в тому, що у процесі ферментативного переносу аміногрупи з глутамінової кислоти на кетокислоту (ПВК) утворюються аланін. Про те, що проходить переамінування роблять висновок по появі аланіну на хромотограмі.

Хід роботи: у дві пробірки відміряють по 0,5 мл розчину глутамінової кислоти, 0,5 мл розчину ПВК, 1 мл розчину вуглекислого калію і 0,25 мл розчину монобромоцтової кислоти.

В 1 пробірку (дослід) додають 0,5 мл свіжої м’язової кашки, у другу пробірку - м’язову кашку, яка попередньо прокип’ячена протягом 1-2 хвилин. Обидві пробірки ставлять у термостат при t = 37^оС на 15 хвилин. Потім у кожну додають по 0,25 мл оцтової кислоти та кип’ятять 2-3 хвилини до повного осадження білків. Вміст пробірок фільтрують.

Фільтрати хроматографують. З цією метою на лінії старту двох смужок фільтровального паперу (дослід та контроль) наносять по краплині фільтратів з пробірок, кожного разу підсушуючи на повітрі. Смужки паперу опускають у пробірки, на дні яких знаходиться фенол, насичений водою. Пробірки у штативі поміщають до термостату на 1 годину при 35-40^оС. Після цього смужки паперу виймають, відмічають лінію фронту (фініш) розчинника, підсушують 10-15 хвилин при 100^оС, а потім проявляють розчином нінгідрину. Знов підсушують.

Для кожної визначеної плями обчислюють коефіцієнт Rf за формулою: Rf = 1/h

де, 1- це відстань від старту до центру плями,

h- відстань від старту до фінішу ( відстань, яку пройшов розчинник).

На основі одержаних даних роблять висновки, хроматограму підклеюють до протоколу.

Rf амінокислот (для фенолу):

Аспарагінова к-та – 0,07	Аргінін – 0,41
Глутамінова к-та – 0,16	Тирозин – 0,52
Цистеїн – 0,19	Аланін – 0,55
Гліцин (глікокол) – 0,30	Фенілаланін – 0,78
Метіонін – 0,39	Лейцин – 0,79

2. Визначення активності амінотрансфераз.

Принцип методу. Амінотрансферази – ферменті які вміщують у якості коферментів фосфопірідоксамін, каналізують зворотній перенос аміногруп з амінокислот на α – кетокислоти. Визначення концентрації α – кетокислот, які утворюються при трансамінуванні лежить в основі дінітрофенілгідразінового методу визначення активності трансаміназ.

Техніка роботи. Визначення аспартатамінотрансферази (АсАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АсАТ, витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин.

Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються при λ = 560нм.

Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АлАТ, витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 30 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідрозіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин. Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються. Контрольні проби обробляють так, як дослідні, але сироватку додають після інкубації проб.

Розрахунок активності ферментів проводять по калібровочному графіку. При будові калібровочного графіку на осі ординат відкладають значення оптичної щільності, а на осі абсцис вміст ПВК.

Фізіологічні рівні: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при t =37^оС.