Ферменты

Ферменты (энзимы) – биологические катализаторы белковой природы. Они содержатся во всех тканях, клетках, внутриклеточных органоидах и биологических жидкостях. Без них не осуществляется ни один химический процесс в организме. Разработка методов выделения и очистки ферментов дала возможность получить их в чистом и кристаллическом виде. Это позволило изучить структуру ферментов, активные и регуляторные центры их молекул, механизм действия, роль простетических групп в катализе и т.д. Как любые белки, ферменты подвержены денатурации, поэтому процедура их получения из биологического материала (ткани животных и растений, микроорганизмы, жидкости) должна быть щадящей, т.е. вестись при температуре 0-4˚С, при рН 5-9 (за исключением особых случаев). Среда для извлечения ферментов не должна содержать примесей тяжелых металлов, которые инактивируют ферменты.

Ферменты делятся на простые и сложные. У простых ферментов функцию контактного и каталитического участков активного центра выполняют только радикалы аминокислот; у сложных – в состав активного центра входят также коферменты и ионы металлов. Сложные ферменты без кофакторов не активны, что нужно учитывать при их идентификации.

1. Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов

Ферменты в отличие от небиологических катализаторов (металлы, кислоты и т.д.) обладают высокой эффективностью катализа, специфичностью действия, способностью ускорять реакции в мягких условиях.

Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала

Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор в 0,3%-ном растворе хлорида натрия, свежеприготовленный; раствор иода в иодиде калия^*; реактив Фелинга^*; пероксид водорода, 10%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; воронка с ватой; стеклянные палочки; глазные пипетки; водяная баня с термометром; пипетки вместимостью 5 мл.

Материал.

1. Разбавленная слюна. Для ее получения промывают рот водой от остатков пищи. Набирают в рот порцию дистиллированной воды около 20 мл и держат ее примерно 2 мин, смешивая языком со слюной. Жидкость со слюной выпускают в стаканчик и профильтровывают через вату в пробирку. Фильтрат используют для работы.

2. Соляная кислота, 10%-ный раствор.

Метод основан на изучении скорости гидролиза крахмала, определяемого по убыли субстрата (крахмал) реакцией с раствором иода или по приросту продукта (мальтоза), выявляемого реакцией Фелинга (образование красного осадка оксида меди). Реагентом на крахмал и декстрины служит иод, образующий с ними окрашенные комплексные соединения (табл.6). Амилоза крахмала при этом дает с иодом комплекс синего цвета, гликоген – красно-бурого, а декстрины в зависимости от молекулярной массы окрашиваются в красно-бурый или желтоватый цвет. Последний обусловлен не образованием комплекса, а находящимся в среде иодом.

Мальтоза как восстанавливающий дисахарид выявляется реакцией Фелинга, которая основана на способности углеводов в щелочной среде восстанавливать ионы Cu²⁺, содержащиеся в жидкости Фелинга в виде комплексного соединения с тартратами, до оксида меди красного цвета, выпадающего в осадок.

Таблица 6. Проба с иодом на крахмал и продукты его гидролиза

Крахмал и продукты его гидролиза	Окрашивание с иодом
Крахмал	Синее
Амилодекстрины	Фиолетовое
Эритродекстрины	Красное
Ахродекстрины	Желтое (окраска раствора иода) или бесцветное
Мальтодекстрины	То же
Мальтоза	То же

Чем выше скорость катализа, тем быстрее исчезает (положительная иод-крахмальная проба) синее окрашивание и усиливается реакция Фелинга на мальтозу.

Ход определения. Берут три пробирки: в первую вносят 1 мл воды, во вторую – 1 мл раствора соляной кислоты, в третью – 1 мл разбавленной слюны. Добавляют во все пробы по 5 мл раствора крахмала, перемешивают их стеклянной палочкой и ставят первую и третью пробирки в водяную баню при 38˚С, а вторую – в кипящую водяную баню. Через 15 мин пробирки охлаждают. Из каждой пробирки отбирают по 5 капель в другие пробирки, добавляют по 1-2 капли раствора иода и сравнивают окрашивание проб.

Для определения мальтозы отбирают по 3 мл из каждой пробирки, прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают верхний слой смеси до кипения. Отмечают появление в пробах красного осадка оксида меди (I).

Оформление работы. Результаты заносят в таблицу.

Катализатор	Субстрат реакции	Продукт реакции	Выявление			Результат
			субстратов	продуктов

В выводах указать разницу в действии катализаторов на скорость гидролиза крахмала.