Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. 40%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 1 М раствор щавелевой кислоты; 0,05 М раствор тиобарбитуровой кислоты; 0,04%-ный раствор гидроксида аммония; 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Оборудование. Центрифуга лабораторная; ФЭК (спектрофотометр); водяная баня; термостат; пробирки с плотно притертыми пробками.

Материал. Кровь забирают натощак из локтевой вены. Добавляют гепарин из расчета 5ед/1мл для предотвращения свертывания. Эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием 3000 об/мин в течение 10 минут и трехкратно отмывают физиологическим раствором. Затем к суспензии эритроцитов добавляют дистиллированную воду и 1-2 капли хлороформа для гемолиза.

Метод основан на способности 5-гидроксиметилфурфурола, образующегося из углеводного компонента гликозилированного гемоглобина при его кислотном гидролизе, образовывать с тиобарбитуровой кислотой окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гликозилированного гемоглобина в эритроцитах.

Ход определения.

1. Определение концентрации гемоглобина в гемолизате.

В пробирку внести 8 мл раствора аммиака и добавить 0,05 мл гемолизата (микропипеткой, многократно промывая ее раствором аммиака). Встряхивать 2 минуты, после чего определить экстинкцию на ФЭКе (длина волны 540 нм, зеленый светофильтр) против раствора аммиака. Содержание гемоглобина в гемолизате в г/л определяют по калибровочному графику.

2. Определение процентного содержания гликозилированного гемоглобина.

В пробирку внести объем гемолизата, содержащего 10 мг гемоглобина, довести до 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия, добавить 1 мл 1 М щавелевой кислоты, плотно закрыть пробкой и инкубировать в термостате при 100˚С в течение 5 часов.

Пробирку охладить, внести 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 оборотов в минуту.

В чистую пробирку отобрать 2 мл надосадочной кислоты, перемешать и инкубировать 40 минут на водяной бане при 40˚С, после чего фотометрируют при длине волны 443 нм против дистиллированной воды.

Содержание гликозилированного гемоглобина (в % от общего) определяют по калибровочному графику.

Практическое значение работы. Содержание гликозилированного гемоглобина в норме составляет от 3 до 5,5% от общего. Известно, что уровень гликозилированного гемоглобина может являться показателем уровня гликемии за предшествующие 2-3 месяца. В связи с этим определением уровня гликозилированного гемоглобина в настоящее время применяют для ранней диагностики и оценки компенсации сахарного диабета. Помимо сахарного диабета, повышение уровня гликозилированного гемоглобина может наблюдаться при кистозном фиброзе, заболеваниях, сопровождающихся укорочением жизни эритроцитов, хронической почечной недостаточности.

Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. Гемоглобин, 5 г/л раствор; риванол, 3 г/л раствор; сульфат аммония, 10%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на осаждении риванолом образующегося комплекса гемоглобин-гаптоглобин. Избыток добавленного к сыворотке крови гемоглобина после осаждения риванолом определяется фотоколориметрически.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,3 мл дистиллированной воды. В контрольную пробирку вносят те же вещества, только вместо раствора гемоглобина приливают 0,2 мл дистиллированной воды.

Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают взбалтыванием, через 10 мин прибавляют в них по 2 мл раствора риванола и оставляют стоять 5 мин.

Пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Прозрачную или слегка опалесцирующую надосадочную жидкость сливают в две чистые пробирки, добавляют по 0,2 мл 10%-ного раствора сульфата аммония (для просветления жидкости) и оставляют стоять при комнатной температуре 20 мин.

В стандартную пробирку помещают 2,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,2 мл сульфата аммония.

Измеряют экстинкцию всех трех проб против воды на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле

[Е_ст – (Е_оп – Е_к)]2000∙0,003

х = ——————————————— ,

Е_ст

где х – содержание гаптоглобинов в сыворотке крови, г/л;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция контрольной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы;

2000 – пересчет на литр сыворотки;

0,003 – содержание гемоглобина в стандартной пробе, г/л.

Оформление работы. По значениям экстинкции рассчитать содержание гаптоглобинов в сыворотке крови. Сделать вывод о возможных изменениях количества гаптоглобинов.

Практическое значение работы. В сыворотке крови взрослого здорового человека концентрация гаптоглобинов составляет 0,28-1,90 г/л. Гаптоглобины входят в состав фракции α-глобулинов сыворотки крови. У новорожденных гаптоглобины, как правило, отсутствуют. Они начинают появляться в возрасте один-два месяца и достигают уровня взрослых к первому полугодию. Гаптоглобины связывают внеэритроцитарный гемоглобин, образуя с ним комплекс. Тем самым гаптоглобин выполняет в организме защитную функцию, например, при разрушении эритроцитов (гемолизе). При гемолизе гаптоглобин препятствует экскреции гемоглобина почками, предотвращая нарушение функции канальцев.