Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека

Реактивы. Раствор ферриацетонциангидрата^*; раствор ацетонциангидрина^*; денатурирующий раствор едкого натрия^*; осаждающий раствор сульфата аммония (3,28 моль/л)^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2 и 5,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; секундомер; обеззоленные фильтры; спектрофотометр или фотоколориметр.

Материал. Гепаринизированная кровь.

Метод основан на способности ацетонциангидрина в присутствии раствора гемоглобина образовывать цианметгемоглобин (гемоглобинцианид), интенсивность окрашивания которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе.

Ход определения. Кровь в количестве 1-2 мл, полученную при наличии гепарина, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования плазму сливают и оставшийся осадок эритроцитов отмывают 8-10 объемами изотонического раствора хлористого натрия. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и отсасывают супернатант. Из полученных эритроцитов готовят эритроцитарную массу путем разведения физиологическим раствором в отношении 1:1, которая и используется для получения гемолизата. С этой целью к 0,2 мл эритроцитарной взвеси добавляют 5 мл раствора ферриацетонциангидрина. В полученном гемолизате проводят определение содержания общего и фетального гемоглобина. При определении общего гемоглобина через 15 минут к 0,1 мл полученного гемолизата добавляют 5 мл раствора ацетонциангидрина. При определении фетального гемоглобина к 3,0 мл гемолизата добавляют 0,2 мл гидроксида натрия (для денатурации нормального гемоглобина) и выдерживают точно 2 минуты (по секундомеру) при температуре 22-24˚С и затем добавляют 3,2 мл раствора сульфата аммония. Пробирку встряхивают несколько раз и через 10 минут содержимое фильтруют через двойной обеззоленный фильтр диаметром 9 см.

Растворы общего и фетального гемоглобина фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 420 нм.

В качестве контроля служат: для определения общего гемоглобина – раствор ацетонциангидрина, для определения фетального гемоглобина – 0,2 мл гидроксида натрия и 3,2 мл сульфата аммония.

Расчет проводится по формуле

фетал.Нв∙(6,4/3,0)∙100

%Нв = —————————————— ,

общий Нв∙51

где 6,4 – конечный объем фетального гемоглобина после денатурации гидроксидом натрия и осаждения сульфатом аммония;

3,0 – исходный объем гемолизата, содержащий общий гемоглобинцианид;

51 – фактор разбавления общего гемоглобинцианида;

100 – перевод в проценты.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать содержание фетального гемоглобина, сравнить с нормой и сделать вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. В норме содержание фетального гемоглобина в эритроцитах составляет 0,75-0,97%. Повышение фетального гемоглобина является важным критерием для диагностики бета-талассемии, при которой одновременно повышается и содержание гемоглобина А₂. Особенно высокое содержание фетального гемоглобина может быть при гомозиготной бета-талассемии до 20-90%. При гетерозиготной форме бета-талассемии содержание фетального гемоглобина может быть нормальным или умеренно повышенным – 2,57%.

Следует отметить, что увеличение содержания фетального гемоглобина однако не является специфичным для бета-талассемии. Оно встречается и при других состояниях: гемолитических анемиях, железодефицитной гипопластической анемии, лейкозах и других состояниях, сопровождающих гипоксией, что вероятно, связано с компенсаторными процессами.