Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
Метаболизм амидопирина осуществляется с помощью ферментативных реакций окисления и конъюгации. Первая из них (N-деметилирование) катализируется монооксигеназной ферментной системой эндоплазматической сети печени по уравнению
Далее
4-аминоантипирин с участием соответствующей
N-ацетилтрансферазы и ацетил-КоА
подвергается ацетилированию:
Реактивы. Фенол перекристаллизованный, 0,02%-ный раствор; аммиачный буфер с рН 10,5-10,6 (20 г хлорида аммония растворяют в 100 мл 25%-ного раствора аммиака); трихлоруксусная кислота, 12,5%-ный раствор; соляная кислота, 36%-ная; гексацианоферрат (III) калия, 1%-ный раствор; 4-аминоантипирин, свежеприготовленный стандартный раствор 1 мг/мл для построения калибровочного графика.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1; 2 и 5 мл; пробирки, обернутые фольгой; воронки с бумажными фильтрами; воронки со стеклянным мелкопористым фильтром; водяная баня; ФЭК или спектрофотометр.
Материал. Моча, содержащая метаболиты амидопирина. Для получения мочи белым крысам внутрибрюшинно вводят раствор амидопирина из расчета 20 мг на 1 кг массы тела, затем отсаживают их в стеклянные выделительные воронки и собирают мочу в мерные цилиндры в течение 12 или 24 ч. Перед исследованием мочу фильтруют через бумажные фильтры.
Метод основан на способности 4-аминоантипирина, являющегося метаболитом амидопирина, при взаимодействии с фенолом в щелочной среде и в присутствии гексацианоферрата (III) калия образовывать соединение типа индофенола, имеющее розовую окраску.
Ход определения. В две пробирки вносят по 1,5 мл профильтрованной мочи. В первую (для определения свободного 4-аминоантипирина) приливают 0,3 мл аммиачного буфера, а во вторую (для определения суммы метаболитов, т.е. 4-аминоантипирина и N-ацетил-4-аминоантипирина) 0,3 мл соляной кислоты. Перемешивают пробы, осторожно встряхивая пробирки.
Содержимое первой пробирки через 15 мин фильтруют через бумажный фильтр; вторую пробирку закрывают пробкой, обернутой фольгой, и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, после чего сразу охлаждают пробу в воде со льдом до комнатной температуры. Охлажденный гидролизат фильтруют через мелкопористый стеклянный фильтр в другую пробирку.
Отбирают из первой пробы 0,6 мл фильтрата в чистую пробирку и добавляют последовательно 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию опытной пробы на ФЭКе (светофильтр зеленый) или на спектрофотометре при 510 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной, содержащей все компоненты, кроме фенола, который заменяется 2 мл дистиллированной воды. Полученная экстинкция (Е1) соответствует содержанию в моче 4-аминоантипирина.
К профильтрованному гидролизату второй пробы приливают 0,6 мл аммиачного буфера, смесь перемешивают и вновь профильтровывают через бумажный фильтр. Отбирают в чистую пробирку 0,8 мл прозрачного фильтрата и добавляют последовательно 0,2 мл дистиллированной воды, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия.
Содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию второй опытной пробы на ФЭКе или на спектрофотометре при тех же условиях, что и для первой пробы. Полученное значение экстинкции (Е2) соответствует содержанию в моче суммы метаболитов (4-аминоантипирин и N-ацетил-4-аминоантипирин).
Расчет. Содержание метаболитов амидопирина в моче и показатели активности ферментных систем печени, участвующих в превращении ксенобиотиков, рассчитывают по калибровочному графику. Для его построения в 5 пробирок вносят соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мл стандартного раствора 4-аминоантипирина. Затем в каждой пробирке доводят общий объем пробы до 5 мл дистиллированной водой и приливают в них по 1 мл аммиачного буфера. Содержимое перемешивают, фильтруют, отбирают в другие пробирки по 0,6 мл фильтрата и обрабатывают его так же, как и при определении свободного 4-аминоантипирина в моче (первая опытная проба). Полученные значения экстинкции соответствуют концентрации 4-аминоантипирина 5, 10, 20, 30 и 40 мкг/л (примерный калибровочный график показан на рис. 13).
По Е1 находят общее количество выделенного 4-аминоантипирина, умножая содержание его в пробе на суточный объем мочи (в мл).
По
Е2
определяют аналогичным образом сумму
метаболитов амидопирина, выделенных
за сутки с мочой.
Относительную активность монооксигеназы печени рассчитывают в % от введенного количества амидопирина по формуле
А100%
—————— ,
В
где А – сумма метаболитов, выделенных с мочой за сутки;
В – количество введенного животному амидопирина.
Ацетилирующую активность ферментных систем организма х (в %) находят по формуле
(Е2 – Е1)100%
х = ——————— ,
Е1
где Е1 и Е2 – соответствующие экстинкции опытных проб.
Оформление работы. Рассчитать относительную активность ферментных систем N-деметилирования и ацетилирования у исследуемых животных и сделать вывод о практическом значении данного теста.
Практическое значение работы. Обстоятельное изучение ферментов печени, осуществляющих реакции гидроксилирования многих соединений и их конъюгацию, открывает возможности косвенной оценки активности изучения состава и соотношения метаболитов разных ксенобиотиков, поступающих в организм. Демонстративность и относительная простота выполнения позволяют использовать эти тесты не только в эксперименте, но и в клинической практике для выявления ранних нарушений различных токсических веществ, производственных факторов и различных лекарств на ферментативные системы гидроксилирования и ацетилирования ксенобиотиков в организме.