Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М с рН 7,4*; пируват натрия, раствор 2∙10-2 М на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4; НАД∙Н динатриевая соль, свежеприготовленный 6∙10-3 М раствор в дистиллированной воде.
Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; стеклянная палочка; секундомер; СФ или ФЭК типа КФК-2.
Материал. Разведенный продажный препарат фермента 0,2 мкг/мл. Кристаллический препарат в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония, имеющий активность около 200 ФЕ/мг белка, разводят в 1000 раз 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,4 перед опытом (1 ФЕ соответствует 1 мкмоль превращенного субстрата за 1 мин)1.
Метод основан на непрерывном измерении скорости окисления НАД∙Н2, используемого на восстановление пирувата в реакции, катализируемой ЛДГ. По уменьшению экстинкции НАД∙Н2 при 340 нм рассчитывают количество превращенного субстрата за единицу времени. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимое превращение пирувата в лактат:
Н
ЛДГ
СН3―С―СООН
+ НАД·Н2
НАД+
+ СН3―С―СООН
║ │
О ОН
пируват лактат
Равновесие реакции сдвинуто вправо, поэтому при изучении ЛДГ удобнее использовать в качестве субстрата пируват и НАД∙Н2 и по скорости окисления последнего рассчитать активность этого фермента.
Ход определения. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора НАД∙Н2 и 0,1 мл образца фермента. Перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кюветодержатель.
Устанавливают шкалу отсчета экстинкции на 0,400 и ручкой «щель» выводят стрелку гальванометра (при открытой шторке) на нуль. В течение 1 мин проверяют отсутствие неферментативного окисления НАД∙Н2 (в этом случае экстинкция не падает).
Добавляет в кювету 0,3 мл раствора пирувата натрия (запускают реакцию), быстро перемешивают, ручкой «щель» при открытой шторке возвращают стрелку гальванометра к нулевой отметке и включают секундомер.
Снимают показания экстинкции (падение ее, начиная от отметки 0,400) через каждые 30 с в течение 2-3 мин. Если условия реакции подобраны верно, то за каждые 30 с наблюдается примерно одинаковое уменьшение экстинкции.
Расчет. Удельную активность ЛДГ х (мкмоль∙мин-1∙мг-1) рассчитывают по формуле
∆Емин3,0∙1000
х = ——————— ,
6,22∙0,02
где ∆Емин – изменение экстинкции в ходе реакции за 1 мин;
6,22 – коэффициент экстинкции 1 мкмоль НАД∙Н2 в 1 мл среды;
3,0 – объем инкубационной смеси, мл;
0,02 – количество белка в кювете, мкг;
1000 – коэффициент пересчета количества белка в миллиграммы.
Оформление работы. Рассчитать удельную активность ферментного препарата, молекулярную активность ЛДГ (учитывая, что ее молекулярная масса 135000). Сделать вывод о качестве исследуемого препарата (сохранность исходной активности, %).
Практическое значение работы. Принципы измерения активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом непрерывного наблюдения используются при исследовании других ферментных препаратов, очищенных ферментов и в клинико-биохимических лабораториях при количественном определении активности ферментов в биологических жидкостях и биоптатах в норме и при патологии.