Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин

и 4-гидроксифенилпировиноградную кислоту

Тирозиноз связан с недостатком фермента 4-гидроксифенилпируватди­ок­сигеназы, вследствие чего тормозится превращение 4-гидроксифенилпиро­виноградной кислоты и тирозина. При этом содержание их в биологических жидкостях увеличивается.

Реактивы. Реактив Миллона^*; L-тирозин, стандартные растворы 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая.

Принцип метода см. работу 1, г.

Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят 1 каплю мочи здорового, а на другую – больного пациента и высушивают полоски на воздухе. На каждое пятно наносят 1 каплю реактива Миллона. Через 2 мин отмечают появление характерного оранжевого окрашивания.

Для полуколичественной оценки результатов на четыре полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле стандартных растворов тирозина, соответствующих концентраций 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 г/л. Подсушивают полоски на воздухе и в эти же зоны вносят по капле реактива Миллона.

Нижняя граница чувствительности реакции при содержании исследуемых субстанций 0,3 г/л. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб мочи с цветной шкалой стандартных растворов тирозина и устанавливают примерное содержание определяемых субстанций в моче.

Оформление работы. Зарисовать цветную шкалу тирозина и окраску исследуемых проб мочи, дать полуколичественную оценку последним. В выводе указать на возможность применения пробы Миллона для экспресс-диагностики тирозиноза.

Практическое значение работы. В норме содержание тирозина в плазме крови у детей до 1 месяца составляет 90-140 и у детей от 2 месяцев до 14 лет – 55-110 мкмоль/л; экскреция с мочой этой аминокислоты у детей до года равна 4-30 и от года до 14 лет – 5-88 мкмоль/сут. При тирозинозе концентрация в этих биологических жидкостях увеличивается в 2 раза и более и пробы на присутствие их становятся положительными.

Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту

Алкаптонурия – наследственное заболевание, связанное с дефектом гомогентизинатоксидазы, осуществляющей превращение гомогентизиновой кислоты в фумарилацетоуксусную. Пи этом заболевании накапливается в средах организма гомогентизиновая кислота.

Реактивы. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; дигидрофосфат калия, 1%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.

а. Проба на гомогентизиновую кислоту со щелочью. Метод основан на окислении гомогентизиновой кислоты кислородом воздуха в щелочной среде с образованием пигментного продукта сине-фиолетового цвета.

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель нормальной, а в другую – патологической мочи, добавляют по 2 капли раствора гидроксида натрия, встряхивают и наблюдают за изменением окраски 1-2 мин.

Проба положительна при наличии сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующего о присутствии гомогентизиновой кислоты.

б. Проба на гомогентизиновую кислоту с молибденовым реактивом. Метод основан на способности гомогентизиновой кислоты восстанавливать молибдат аммония с образованием молибденовой сини (см. работу 11).

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 капли мочи здорового, в другую – 2 капли мочи больного пациента. В каждую пробирку добавляют по 10 капель воды и по 4 капли раствора однозамещенного фосфата калия. Пробирки встряхивают.

Проба положительна при наличии синего окрашивания, обусловленного присутствием в моче гомогентизиновой кислоты.

Оформление работы. Отметить наличие гомогентизиновой кислоты в исследуемой моче; в выводе указать на возможность использования применяемых проб для диагностики.

Практическое значение работы. Пробы на гомогентизиновую кислоту используются для диагностики алкаптонурии, так как в норме эта кислота в моче отсутствует.