Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина

Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2^*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин^*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37˚С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.

Ферментативная реакция протекает по уравнению

Ход работы. В две пробирки – контрольную и опытную – вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37˚С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.

Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.

Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.

Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.

№№ пробы	Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл	Пирофосфатный буфер, мл	Активирующий раствор, мл	Раствор гистидина, мл	Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль
1	0	0,3	1,0	1,0	0
2	0,05	0,3	1,0	1,0	0,005
3	0,10	0,3	1,0	1,0	0,010
4	0,15	0,3	1,0	1,0	0,015
5	0,20	0,3	1,0	1,0	0,020
6	0,30	0,3	1,0	1,0	0,030
7	0,40	0,3	1,0	1,0	0,040

Расчет производят по формуле

Е200

х = ————— ,

2

где х – активность гистидазы в сыворотке крови, мкмоль/(ч∙л);

Е – содержание уроканиновой кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;

200 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

2 – коэффициент пересчета на 1 ч.

Оформление работы. По полученным экстинкциям рассчитать активность гистидазы в сыворотке крови, сравнить ее с нормой и указать причины возможных отклонений.

Практическое значение работы. Гистидаза содержится преимущественно в печени и коже человека и относится к органоспецифичным для них ферментам. При поражении этих органов, главным образом печени, наблюдается поступление этого фермента в кровь. В норме активность гистидазы в сыворотке крови определяется в виде следов примерно у 1-2% здоровых пациентов. Лишь у грудных здоровых детей регистрируется активность этого фермента в сыворотке крови. При заболеваниях печени в сыворотке крови выявляется гистидазная активность, причем степень ее увеличения характеризует тяжесть патологического процесса.