Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом

Реактивы. Комплексон III, 0,665 г/л раствор; гидроксид натрия, 9 М раствор; мурексид, растертый в тонкий порошок с NaCl в соотношении 1:50.

Оборудование. Конические колбочки вместимостью 50 мл; микробюретка.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности мурексида образовывать с ионами кальция в щелочной среде комплексные соединения, окрашенные в красно-фиолетовый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации). При титровании раствором более сильного комплексообразователя (комплексон III) это комплексное соединение разрушается и связанный мурексид вновь освобождается, что приводит к появлению его натуральной окраски (фиолетовой или бледно-сиреневой). Объем комплексона III, пошедший на титрование, пропорционален содержанию кальция в сыворотке крови.

Ход определения. В коническую колбочку вносят 50 мл дистиллированной воды, 0,4 мл раствора гидроксида натрия, на кончике скальпеля мурексид и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется бледно-сиреневая окраска, обусловленная цветом самого индикатора.

Отбирают 25 мл полученного раствора в колбочку для титрования (оставшийся раствор служит эталоном сравнения) и добавляют 0,5 мл сыворотки крови, при этом появляется бледно-розовое окрашивание, обусловленное образованием кальциево-мурексидного комплекса.

Смесь титруют раствором комплексона III до первоначальной окраски индикатора. Конец титрования контролируют, сопоставляя окраску опытной пробы с эталоном (неиспользованная часть раствора).

Расчет. Содержание кальция рассчитывают по формуле

V72

х = —————————— ,

40∙0,5

где х – содержание кальция в сыворотке крови, ммоль/л;

V – объем раствора комплексона III, пошедший на титрование, мл;

0,5 – объем сыворотки, взятый на исследование, мл;

72 – коэффициент пересчета количества кальция на 1 л сыворотки с учетом эквивалентности комплексообразователя;

40 – молекулярная масса кальция.

Оформление работы. Рассчитать содержание кальция в сыворотке крови (в ммоль/л), сравнить с нормой и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме содержание кальция в сыворотке крови составляет 2,25-2,75 ммоль/л. Гиперкальциемия наблюдается при гипервитаминозе D, гиперпаратиреоидизме, при сердечной недостаточности, желтухе. Гипокальциемия встречается при спазмофилии, рахите, хронических заболеваниях почек, гипопаратиреоидизме и т.д.

Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер

Реактивы. 10%-ный спиртовой раствор тимола^*; буферный раствор^*; тимолововероналовый буфер^*; стандартный раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки на 0,2 и 10 мл; фотоэлектроколориметр.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

Метод основан на взаимодействии белков сыворотки крови с тимолово-вероналовым буфером, при этом появляется мутность вследствие образования глобулино-тимоло-фосфолипидного комплекса.

Ход определения. К 6,0 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, оставляют стоять 30 минут, затем фотометрируют при 660 нм против буферного раствора в кюветах с толщиной 10 мм. Реакцию проводят при температуре +25˚С. Расчет ведут по калибровочной кривой.

Примечание. Для получения точных данных важным является взятие крови натощак: алиментарная гиперлипемия существенно влияет на результаты исследования. При постановке пробы может использоваться сыворотка, хранившаяся в течение нескольких дней. Умеренный гемолиз не отражается на результатах исследования.

Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику проводят определение величины тимоловой пробы.

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора готовят разведение, соответствующее единицам помутнения по S-H. Так, 1,35 мл суспензии и 4,65 мл 0,2 н серной кислоты соответствует 5 S-H помутнения; 2,70 мл суспензии и 3,30 мл кислоты – 10 S-H; 5,40 мл суспензии и 0,60 мл кислоты – 20 S-H помутнения.

Разведения смешивают, хорошо встряхивают и фотометрируют при длине волны 660 нм (630-690 нм – красный светофильтр) против воды в кюветах на 10 мм. По полученным данным строят калибровочную кривую

Оформление работы. После определения величины тимоловой пробы по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях и причинах их отклонений.

Практическое значение работы. В норме составляет 0-4 ед (SH). Тимоловая проба более пригодна для функционального исследования печени. Она положительна при болезни Боткина, при токсическом гепатите, коллагеновых заболеваниях, малярии и вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна, что имеет дифференциально-диагностическое значение.