Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие фосфат от различных субстратов. Среди них имеются энзимы с неодинаковой специфичностью по отношению к субстратам. Щелочная фосфатаза действует в щелочной среде (чем отличается от фосфатаз, осуществляющих катализ в нейтральной или кислой средах) и является малоспецифичной.

Реактивы. β-Глицерофосфат, щелочной раствор на мединаловом буфере с рН 8,6^*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KH₂PO₄, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочной кривой).

Оборудование. Штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на фотоколориметрическом определении неорганического фосфора, отщепляемого от β-глицерофосфата под действием фосфатазы сыворотки крови в щелочной среде:

СН₂ОН СН₂ОН

│ Фосфатаза │

НС―О―РО₃Н₂ + Н₂О НС―ОН + Н₃РО₄

│ рН 8,6 │

СН₂ОН СН₂ОН

β-глицерофосфат глицерин

Неорганический фосфат определяют по образованию фосфомолибдата аммония с последующим восстановлением его в молибденовую синь аскорбиновой кислотой (см. работу 11).

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 мл раствора β-глицеро­фосфата и помещают на 5 мин в водяную баню при 37˚С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и отмечают время начала инкубации в водяной бане.

Через 1 час приливают в обе пробирки по 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную – еще 0,2 мл сыворотки крови. Перемешивают пробы, оставляют стоять 5 мин для осаждения белка. Центрифугируют содержимое обеих проб в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Отбирают в чистые пробирки по 1,5 мл надосадочной жидкости (для определения в ней неорганического фосфата Ф_н) и приливают по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб на ФЭКе, при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против раствора реактивов (1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1,5 мл дистиллированной воды).

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробы	Раствор KH2PO4, мл	Н2О, мл	Трихлор­уксусн. кислота, мл	Молибдат аммония, мл	Аскорбиновая кислота, мл	Фн в пробе, мг	Активность фермента, ммоль/(ч∙л)
1	0,1	0,9	0,5	1,0	1,0	0,001	0,32
2	0,2	0,8	0,5	1,0	1,0	0,002	0,64
3	0,4	0,6	0,5	1,0	1,0	0,004	1,29
4	0,6	0,4	0,5	1,0	1,0	0,006	1,93
5	1,0	-	0,5	1,0	1,0	0,010	3,22

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч∙л).

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч∙л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение – при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.