Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
Реактивы. Соляная кислота, 0,1 М раствор; окислительная смесь*; Н-бутанол; этанол, 96%-ный; тиамин, стандартный раствор концентрации 10 мкг/мл; уксусная кислота, ледяная; перманганат калия, 4%-ный раствор; гидроксид водорода, 3%-ный раствор; гидросульфит натрия, порошок; рибофлавин, стандартный раствор концентрации 0,005 мг/мл.
Оборудование. Штатив с пробирками; пенициллиновые флакончики с полиэтиленовыми пробками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; мерный цилиндр вместимостью 50 мл; ступка с пестиком; флуориметр ЭФ-3 или БИАН.
Материал. Драже поливитаминов.
а. Определение содержания тиамина. Метод основан на способности тиамина окисляться гексацианоферратом (III) калия в щелочной среде в тиохром, который после извлечения его из раствора бутиловым спиртом дает в ультрафиолетовом свете сине-голубую флуоресценцию:
Ход определения. Драже поливитаминов разминают в ступке, добавляя 30 мл раствора соляной кислоты, и тщательно перемешивают.
В один флакончик (контроль) вносят 5 мл соляной кислоты, во второй (опыт) – 1 мл водного экстракта драже витаминов и 4 мл дистиллированной воды, в третью (стандарт) – 5 мл раствора тиамина.
Во все флакончики приливают по 1,5 мл окислительной смеси и осторожно встряхивают их до полного перемешивания. Затем добавляют в них по 5 мл бутанола, плотно закрывают пробками и интенсивно встряхивают 5 мин. После расслоения жидкости осторожно прибавляют по 0,5 мл этанола (для просветления бутанола).
Осторожно сливают просветленный бутанольный слой в кювету флуориметра и измеряют интенсивность флуоресценции опытной и контрольной проб со стандартным раствором тиамина.
Расчет проводят по формуле
(Еоп – Ек)0,01·1·5,5
х = —————————— ,
Ест30
где х – содержание тиамина в драже, мг;
Еоп – показания флуориметра для опытной пробы;
Ек – показания флуориметра для контрольной пробы;
Ест – показания флуориметра для стандартной пробы;
0,01 – концентрация тиамина в стандартном растворе, мг/мл;
30 – объем экстракта драже, мл;
1 – объем экстракта, взятого на исследование, мл;
5,5 – объем пробы, просветленной этанолом, мл.
б. Определение содержания рибофлавина. Принцип метода см. работу 73, е.
Ход определения. Драже поливитаминов разминают в ступке, добавляя 30 мл раствора соляной кислоты, и тщательно перемешивают.
В одну пробирку вносят 7 мл дистиллированной воды, во вторую (опытную) – 2 мл экстракта драже и 5 мл дистиллированной воды, в третью (стандартная) – 1 мл стандартного раствора рибофлавина и 6 мл воды.
Во все пробирки приливают по 10 капель ледяной уксусной кислоты и по 1,5 мл раствора перманганата калия (для окисления посторонних флуоресцирующих веществ).
Содержимое пробирок встряхивают и добавляют по каплям (примерно 5 капель) гидроксид водорода при постоянном помешивании стеклянной палочкой до полного просветления жидкости. Растворы отстаивают 5 мин, до прекращения выделения пузырьков газа. Сливают жидкость в кюветы флуориметра и измеряют интенсивность флуоресценции всех проб.
Расчет проводят по формуле
(Еоп – Ек)2·0,005·7
х = —————————— ,
Ест30
где х – содержание рибофлавина в драже, мг;
Еоп – показания флуориметра для опытной пробы;
Ек – показания флуориметра для контрольной пробы;
Ест – показания флуориметра для стандартной пробы;
30 – объем экстракта драже, мл;
2 – объем экстракта драже, взятого на исследование, мл;
0,005 – концентрация рибофлавина в стандартном растворе, мг/мл;
7 – объем флуориметрируемых проб, мл.
Оформление работы. Рассчитать содержание исследуемых витаминов в драже и сделать вывод о возможности практического использования флуориметрического метода.
Практическое значение работы. Флуориметрические методы определения тиамина и рибофлавина применяются для определения этих витаминов в пищевых продуктах, лекарственных растениях и готовых лекарственных препаратах, а также для изучения обеспеченности ими организма. Обеспеченность этими витаминами может быть определена по их уровню в крови и по экскреции с мочой. Низкое содержание витаминов в организме наблюдается при гиповитаминозах, болезнях печени, сердечно-сосудистых заболеваниях, заболеваниях желудочно-кишечного тракта и других патологических состояниях.