- •Предисловие
- •Введение в биохимический практикум
- •I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
- •2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях
- •3. Основные приборы, используемые в практикуме
- •Фотометрические приборы
- •Флуориметрические приборы
- •Центрифуги
- •Приборы для электрофореза
- •4. Применение единиц си для выражения результатов клинико-биохимических исследований Общие положения
- •Некоторые рекомендации по применению единиц си в клинико-биохимических исследованиях
- •1.Химическая природа простых белков
- •Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот
- •Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов
- •Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
- •2. Исследование физико-химических свойств белков
- •Работа 4. Диализ белков
- •Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка
- •Приготовление буферных систем для определения иэт казеина
- •Работа 6. Исследование денатурации белков
- •Работа 7. Исследование высаливания белков
- •3. Количественный анализ белков
- •Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
- •4. Состав и свойства сложных белков
- •Работа 9. Химическая природа гемпротеидов
- •Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
- •Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
- •Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
- •Нуклеиновые кислоты
- •1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот
- •Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот
- •Количественные методы определения нуклеиновых кислот
- •Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину
- •Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот
- •Работа 17. Исследование фосфолипидов
- •Работа 18. Качественные реакции на стероиды
- •Ферменты
- •Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов
- •Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала
- •2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам
- •Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Работа 21. Обнаружение холинэстеразы
- •В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа
- •Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской
- •Построение калибровочного графика
- •Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
- •В сыворотке крови
- •3. Изучение кинетических свойств ферментов
- •Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны
- •4. Специфичность действия ферментов
- •Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности
- •5. Модификаторы активности ферментов
- •Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
- •Мышечной ткани
- •Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови
- •6. Количественное определение активности ферментов
- •Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
- •Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
- •Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
- •7. Исследование изоферментов
- •Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
- •Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови
- •Биохимия пищеварения
- •Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока
- •Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»
- •Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта
- •Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы
- •Энергетический обмен (биоэнергетика)
- •1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани
- •Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей
- •Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
- •Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
- •Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
- •Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов
- •Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
- •Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
- •Обмен углеводов
- •Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови
- •Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
- •Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
- •Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
- •Обмен липидов
- •Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
- •Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай
- •Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька
- •Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови
- •Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии
- •Обмен белков и аминокислот
- •Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом
- •Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Катепсины
- •Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
- •Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина
- •Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева
- •Обмен азотсодержащих небелковых веществ
- •1. Исследование общих продуктов азотистого обмена
- •Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна
- •2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов
- •Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта
- •3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена
- •Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу
- •Молекулярная патология
- •1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии
- •Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
- •Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин
- •Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту
- •Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче
- •2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
- •Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
- •Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды
- •Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
- •Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
- •Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
- •Регуляторы обмена веществ
- •1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины
- •Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
- •Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях
- •2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов
- •Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.
- •Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот
- •Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты
- •Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных
- •Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману
- •Исследование биологических жидкостей
- •1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению
- •Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека
- •Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови
- •Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом
- •Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом
- •Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер
- •Работа 93. Сулемово-осадочная реакция
- •Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови
- •2. Биохимическое исследование мочи
- •Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи
- •Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче
- •Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова
- •Работа 98. Качественное определение индикана в моче
- •Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
- •Метаболизм ксенобиотиков
- •Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
- •Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу
- •Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
- •Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
- •Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова
- •Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева
- •Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
- •Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
- •Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу
- •Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах
- •Приложение
- •2.Биохимические показатели плазмы крови
- •1.Общие клинические нормы
- •2. Специальное исследование мочи
- •Желудочный сок
- •2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)
- •3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)
- •4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)
- •5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)
- •3. Приготовление некоторых реактивов
- •Оглавление
Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
Реактивы. Реактив метаванадата аммония*; соляная кислота, 0,5 М раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пробки, обернутые фольгой; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня.
Материал. Моча, содержащая свободную и ацетилированную формы ГИНК. (Для получения мочи белым крысам вводят порошок ГИНК в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в виде взвеси в 3 мл воды через рот с помощью специального зонда. Крыс отсаживают на 12 ч в стеклянные выделительные воронки для сбора мочи. Объем мочи доводят водой до 10 мл и фильтруют через бумажный фильтр).
Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричнево-красного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза указывает на степень ацетилирования ГИНК в организме:
Ход определения. Собранную мочу разводят в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки вносят по 1 мл разведенной мочи; в одну из них (для определения общей ГИНК, т.е. суммы свободной и ацетилированной форм препарата) добавляют 1 мл раствора соляной кислоты, а во вторую (для выявления свободной ГИНК) – 1 мл дистиллированной воды.
Первую пробирку закрывают пробкой и ставят на 20 мин на кипящую водяную баню, после чего охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки приливают по 2 мл реактива метаванадата аммония и отмечают разницу в окрашивании исследуемых проб мочи.
Оформление работы. По разнице в окраске проб мочи дать примерную оценку степени ацетилирования ГИНК в организме и указать на значение этой реакции для практики.
Практическое значение работы. Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется специальной ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. В зависимости от активности этого фермента у разных людей их делят на быстрых и медленных «инактиваторов» (ацетиляторов) ГИНК, что имеет значение не только для практической фармакогенетики, но и для рациональной терапии. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата для конкретного больного.
Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
Пероксидное (перекисное) окисление липидов молекулярным методом представляет собой цепной свободно-радикальный процесс. Наиболее легко подобным образом окисляются ненасыщенные липиды или свободные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов биологических мембран. Поэтому скорость пероксидного окисления липидов прежде всего оказывает влияние на функцию мембран и на развитие в них патологических изменений.
Зарождение этого процесса связывают с появлением в среде, например, пероксидного радикала НО2˙, возникающего при окислении Fe2+ молекулярным кислородом:
Fe2+ + O2 + H+ → Fe3+ + HO2˙
Пероксидный радикал может реагировать с молекулой ненасыщенного липида или свободной жирной кислоты (RH) биомембран. При этом образуется липидный радикал R˙.
HO2˙ = RH →H2O2 + R˙ ,
который запускает цепную реакцию окисления липидов (стадия инициирования, или зарождения цепей). Образование R˙ связано с отрывом атома водорода от углерода, находящегося в α-положении к двойной связи, например, в положениях 8, 11, 14 и 17 линоленовой кислоты:
Если радикал образуется при отрыве атома водорода в положении 11 или 14, то электрон неспаренной валентности делокализуется, что приводит к появлению молекул липида с двумя сопряженными двойными связями (диеновые конъюгаты), имеющих максимум поглощения при 233 нм.
В присутствии кислорода радикал R˙ дает новый свободный радикал липида – пероксидный RO2˙.
Пероксидный радикал может взаимодействовать с новой молекулой жирной кислоты RH с образованием гидропероксида (гидроперекиси) липида ROOH и очередного липидного радикала R˙;
Причем сопряженные двойные связи (диеновая конъюгация), отмеченные в формулах скобкой, сохраняются в гидропероксидах липидов, образующих при свободнорадикальном окислении таких полиненасыщенных жирных кислот, как линолевая, линоленовая, арахидоновая. Две последние реакции сохраняют присутствие радикалов RO2 и R в системе, обеспечивая продолжение цепного окисления липидов:
Подобная цепь пероксидного окисления липидов называется неразветвленной. Длина ее зависит от числа радикалов RO2˙, которые «ведут» цепное окисление. Каждый радикал приводит к образованию нескольких молекул ROOH, по числу которых судят о длине неразветвленных цепей пероксидного окисления липидов. Следовательно, первичными продуктами пероксидного окисления липидов являются гидропероксиды липидов, среди которых определенный процент падает на диеновые конъюгаты.
При разложении накопившихся гидропероксидов липидов с участием Fe2+ появляется новый радикал – RO (оксидный радикал жирной кислоты, или алкоксидный радикал):
ROOH + Fe2+ → RO + OHˉ + Fe3+
Далее пероксидное окисление липидов развивается по разветвленному механизму:
При этом накапливаются другие продукты пероксидного окисления липидов: спирты, кетоны, эпоксиды, альдегиды и диальдегиды и т.д. Среди диальдегидов представляет интерес малоновый диальдегид CH2(CHO)2, который образуется при свободнорадикальном окислении линоленовой и арахидоновой кислот, но не олеиновой или линолевой. Его определение служит одним из методов исследования пероксидного окисления липидов.
Пероксидное окисление фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав биомембраны, может полностью разрушить ее липидную основу.
Однако этому препятствует взаимодействие радикалов R˙ и RO2 друг с другом, реакция тех же радикалов с Fe2+ и взаимодействие радикалов с антиоксидантами. При этом в первых двух реакциях образуются молекулярные продукты, а в третьей – малоактивные радикалы антиоксиданта, что вызывает обрыв цепей свободнорадикального окисления.
В клетках выделяют два типа пероксидного окисления липидов – ферментный и неферментный, которые отличаются рядом признаков. Ферментная система требует участия ферментного белка (поэтому в отличие от неферментной инактивируется нагреванием), пирофосфата, ионов железа и в качестве восстановителя НАДФ·Н (НАДФ·Н-зависимая ферментная система пероксидного окисления, НЗП). Неферментная система нечувствительна к нагреванию; она требует ионов железа и аскорбата в качестве восстановителя (аскорбат-зависимое неферментное пероксидное окисление, АЗП). Отличительным признаком этих двух систем служит чувствительность к ионам железа, пирофосфата и фосфата. Система НЗП имеет очень высокое сродство к ионам железа, поэтому достаточно следовых количеств их для протекания максимальной скорости реакций. Для тех же условий АЗП требует значительных концентраций ионов железа, которые добавляются в среду при исследовании этого процесса в клетках. Активность НЗП резко усиливается пирофосфатом и угнетается фосфатом, тогда как АЗП ингибируется обоими веществами.
Наиболее активны обе системы пероксидного окисления в мембранах микросом. Обнаружено также пероксидное окисление липидов, особенно АЗП, в митохондриях, лизосомах, мембранах эритроцитов и т.д.
Накопление таких продуктов пероксидного окисления, как гидропероксиды липидов, приводит к ингибированию многих ферментных белков и нарушает их функцию. Кетоны, альдегиды и диальдегиды образуют ковалентные внутримолекулярные и межмолекулярные связи («сшивки») и с функциональными группами белков и других биомолекул, что также ведет к изменениям клеточных функций.
Развитию свободнорадикальных реакций окисления липидов способствуют прооксиданты, а сдерживают его ингибиторы – антиоксиданты. К последним относятся α-токоферол, селен, некоторые гормоны (тироксин, стероидные) и т.д. От вредного действия гидропероксидов липидов клетку защищает ферментная система глутатионпероксидазы, разрушающая эти вещества.
Для исследования процессов пероксидного окисления липидов используются методы: а) определения продуктов пероксидного окисления липидов; б) регистрации свободных радикалов в ходе реакции; в) определения антиокислительной (антиоксидантной) активности тканей. Первые два наиболее просты для выполнения и нашли широкое применение, в частности, метод определения наиболее изученного продукта пероксидного окисления – малонового диальдегида.