Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче

Реактивы. Уксусная кислота ледяная; хлорная кислота 57%; натрия ацетат 3-х водный; дельта-аминолевулиновая кислота гидрохлорид; уголь активированный с дисперсностью 0,25-1 мм; ацетил-ацетон; п-диметиламинобензальдегид; ацетатный буфер рН 3,6^*; взвесь угля^*; реактив Эрлиха^*; беззольные фильтры (синяя лента), калибровочный раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки вместимостью 0, 1, 2,0 и 10 мл; пробирки с притертыми пробками; спектрофотометр.

Материал. Моча. Хранится в холодильнике, рН мочи должен быть равен 6,0, для чего добавляют на 10 мл мочи 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Метод основан на способности дельта-аминолевулиновой кислоты взаимодействовать с п-диметиламинобензальдегидом после удаления порфобилиногена и других мешающих определению веществ с помощью активированного угля. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации данной кислоты в пробе.

Ход определения. К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвеси активированного угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию взбалтывают 1 минуту и фильтруют через бумажный фильтр. В две пробирки (контрольную и опытную) отбирают по 2 мл фильтрата. В опытную пробу добавляют 0,05 мл ацетилацетона, в контрольную – такое же количество ацетатного буфера. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробирки помещают на 20 минут в кипящую водяную баню, охлаждают, доводят объем жидкости ацетатным буфером до 2 мл и в каждую пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха, перемешивают. Через 15 минут спектрофотометрируют опытную пробу против контрольной при длине волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение часа.

Расчет. Содержание дельта-аминолевулиновой кислоты проводят по калибровочному графику, условия построения которого представлены в таблице.

№№ пробирки	Рабочий калибровочный раствор, мл	Ацетатный буфер рН 3,6, мл	АЛК в пробе (2 мл)
			мкг	мкмоль
1	0,1	4,9	0,04	0,0003
2	0,3	4,7	0,12	0,0009
3	0,5	4,5	0,20	0,0015
4	0,7	4,3	0,28	0,0021
5	1,0	4,0	0,40	0,0030
6	2,0	3,0	0,80	0,0060

Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора в две пробирки (контрольную и опытную), которые обрабатывают как указано выше. По полученным данным строят калибровочный график.

Расчет. При расчете рекомендуется проводить пересчет на 1 г креатинина, т.к. диурез за сутки может быть различным.

Содержание АЛК в моче рассчитывают по формуле с использованием калибровочного графика:

С·10

АЛК = ————— ,

А·2

где С – количество АЛК в пробе (мкмоль), найденное по калибровочному графику;

А – содержание креатинина в пробе (г);

10 – коэффициент разведения мочи;

2 – объем фильтрата (мл).

Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в микромоли – 0,0076.

Оформление работы. По полученным экстинкциям сделать расчет содержания дельта-аминолевулиновой кислоты и вывод о причине возможных изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание АЛК в моче 3,9-19 мкмоль/г креатинина (0,52-2,5 мг/г креатинина). Выделение аминолевулиновой кислоты с мочой увеличивается при патологических процессах, связанных с нарушением порфиринового обмена, а также при интоксикации свинцом, бензолом и другими токсическими веществами.