Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете

Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,08 М раствор с рН 7,4^*; хлорид магния, 0,16 М раствор; анилин перегнанный, 0,03 М раствор; трихлоруксусная кислота, 15%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; фенол, 2%-ный раствор в 0,2 М растворе гидроксида натрия; НАДФ∙Н, 0,03 М раствор; биуретовый реактив^*; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; реактивы для выделения микросом, как в работе 86; 4-аминофенол, свежеприготовленный раствор для построения калибровочного графика. (5,45 мг/л).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторная центрифуга с центрифужными весами; центрифуга рефрижераторная ЦЛР; ФЭК типа КФК-2 или спектрофотометр.

Материал. Печень животного после забоя.

Метод основан на определении содержания 4-аминофенола, образующегося при гидроксилировании анилина в монооксигеназной цепи микросом и с участием цитохрома Р₄₅₀:

4-аминофенол при взаимодействии с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный индофенольный комплекс синего цвета:

Ход определения. Выделяют фракцию микросом печени, как указано в работе 100, затем определяют содержание белка в полученной микросомальной фракции; для этого отбирают 0,05 мл взвеси микросом в пробирку, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0.2 мл биуретового реактива. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой и через 30 мин измеряют экстинкцию этого раствора против контрольного (4 мл гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива) на ФЭКе и СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Рассчитывают концентрацию белка по калибровочному графику (содержание белка в 0,1 мл взвеси микросом должно составлять примерно 2-4 мг).

Для изучения гидроксилирования анилина берут две чистые пробирки и готовят контрольную и опытную пробы. Последовательность внесения компонентов и их объем приведены в таблице.

Контроль			Опыт
вещество	объем	вещество		объем
Трис-HCI буфер	0,4	Трис-HCI буфер		0,4
Хлорид магния	0,4	Хлорид магния		0,4
Взвесь микросом	0,1	НАДФ∙Н		0,2
Трихлоруксусная кислота	0,5	Взвесь микросом		0,1
Анилин	0,11	Анилин		0,11
НАДФ∙Н	0,2

Обе пробирки помещают на 20 мин в водяную баню при 37˚С, после чего в опытной пробе останавливают реакцию, приливая 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Далее обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Отбирают из каждой пробы по 1 мл надосадочной жидкости, переносят их в две другие пробирки. Затем приливают к ним по 0,5 мл карбоната натрия и по 1,5 мл раствора фенола. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Для развития окраски пробирки помещают на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Затем измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе или СФ при 630 нм (светофильтр красный).

Серию растворов для построения калибровочного графика готовят согласно таблице.

№ про­бирки	4-амино­фенол, мл	Вода, мл	Nа2СО3, мл	Фенол, мл	Содержание 4-амино­фенола в пробе, нмоль
1	0,1	0,9	0,5	1,5	5,0
2	0,2	0,8	0,5	1,5	10,0
3	0,3	0,7	0,5	1,5	15,0
4	0,4	0,6	0,5	1,5	20,0
5	0,5	0,5	0,5	1,5	25,0
6	0	1,0	0,5	1,5	0 (контроль)

Затем пробирки ставят на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Измеряют экстинкцию проб против контроля, как описано выше, и строят калибровочный график.

Расчет проводят по формуле

АV

х = ——— ,

20m

где х – гидроксилазная активность нмоль/(мин∙мг белка);

А – содержание 4-аминофенола в пробе, найденное по калибровочному графику, нмоль;

V – объем пробы, равный 1,71 мл;

20 – время инкубации, мин;

m – содержание белка в пробе, мг.

Практическое значение работы. Для изучения функции микросомальной цепи окисления печени в норме и особенно при патологических состояниях используют различные методические подходы. В частности, исследования проводят с разными субстратами, превращение которых происходит на цитохроме Р₄₅₀. При взаимодействии с цитохромом Р₄₅₀ разные субстраты дают неодинаковые спектры поглощения. По этому признаку их условно делят на субстраты I типа (к ним относятся, например, амидопирин, бензфетамин, этилморфин и др.) и II типа (анилин), что связано, возможно, с некоторыми различиями в механизме гидроксилирования данных соединений.

Скорость реакций гидроксилирования изменяется при действии многих внешних факторов (радиации, гипероксии, гипоксии, интоксикации четыреххлористым углеродом и т.д.), под влиянием ряда регуляторов (витаминов, гормонов). Для получения более полной информации о деятельности гидроксилазной активности микросом печени при действии многих факторов и при патологии используют разные ксенобиотики – субстраты цитохрома Р₄₅₀.