Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии

Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, глицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами иода.

Реактивы. Этанол – диэтиловый эфир (3:1); хлороформ; растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2); иод металлический.

Оборудование. Пластинки хроматографические Силуфол УФ₂₅₄; камера для хроматографии; водяная баня; камера для проявления хроматограмм; хроматоскоп.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спирто-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спирто-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в широкогорлую пробирку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают 2-3 мл растворителя. Пастеровской пипеткой наносят на хроматографическую пластину, отступя 1 см от края, 0,01-0,02 мл хлороформного экстракта, помещают пластину в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.

Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического иода. Сосуд закрывают и подогревают в водяной бане при 60˚С. Возгоняющийся иод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноглицериды, свободные жирные кислоты, триглицериды и эфиры холестерина.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Указать в выводах возможность дальнейшего количественного определения липидных компонентов.

Обмен белков и аминокислот

В обмене белков можно условно выделить два этапа: первый – распад белков (в том числе апопротеинов сложных белков) до аминокислот и второй – превращение аминокислот до конечных продуктов метаболизма (мочевина, СО₂ и Н₂О) или до некоторых азотсодержащих производных (биогенные амины, креатин, порфирины и т.д.). Для оценки состояния белкового обмена организма исследуют содержание белков и отдельных их фракций в сыворотке крови, аминокислот, а также активность ферментов, катализирующих отдельные стадии превращения белков и аминокислот.