Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 5,4*; пероксид водорода, 0,03%-ный раствор; бензидин, 0,92 г/л раствор на ацетатном буфере*.
Оборудование. Колбы вместимостью 25 мл; пипетки вместимостью 5 мл; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; ФЭК.
Материал. Листья растений, свежие.
Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы.
Реакция
описывается уравнением.
Ход определения. Навеску 100 мг растительного материала помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.
Для определения активности фермента берут кювету с толщиной слоя 2 см и наливают в нее по 2 мл водной вытяжки из листьев, ацетатного буфера и раствора бензидина. Ставят кювету в кюветодержатель и устанавливают стрелку прибора на нулевую отметку, затем добавляют 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете) и одновременно с добавлением пероксида включают секундомер. Раствор в кювете начинает синеть и по мере нарастания интенсивности окраски стрелка прибора отклоняется. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра отметки 0,250. Повторяют определение трижды и берут среднее значение времени.
Расчет. Активность фермента рассчитывают по формуле
∆Е 25∙1000
х = ———————— ,
t∙d 0,1∙2
где х – активность пероксидазы, Е∙с-1∙кг-1 (Е – единица экстинкции);
∆Е – изменение экстинкции, равное 0,250;
t – время реакции, с;
d – толщина слоя кюветы, равная 2;
1000 – коэффициент пересчета граммов в килограммы;
0,1 – навеска, г;
2 – объем пробы, мл.
После сокращений формула принимает вид
15625
х = —————
t
Оформление работы. Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выводе отметить биологическое значение фермента.
Практическое значение работы. Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет перокисдазную активность в отношении практически всех фенолов (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.), ароматических аминов (бензидин, n-фенилендиамин и др.), аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д.
В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении флороглюцина, НАД∙Н2, НАДФ∙Н2, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д.
В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Пероксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента.