Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды

Мукополисахаридозы – врожденное нарушение обмена кислых гетерополисахаридов. При этом заболевании появляются мукополисахариды в моче. Аналогичное явление наблюдается также при ревматоидном артрите и других повреждениях соединительной ткани.

Реактивы. Толуидиновый синий, 0,1%-ный раствор в водном ацетоне, разведенном с водой в соотношении 4:1; уксусная кислота, 10%-ный раствор.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов (пурпурного цвета) при взаимодействии мукополисахаридов с толуидиновым синим в кислой среде.

Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят каплю нормальной мочи, на вторую – каплю патологической. Полностью высушивают их при комнатной температуре и помещают в раствор толуидинового синего. Через 1 мин бумажки вынимают из красящего раствора и отмывают в растворе уксусной кислоты.

Проба положительна при развитии пурпурной окраски, говорящей о наличии мукополисахаридов в моче.

Оформление работы. Отметить наличие окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данной пробы.

Практическое значение работы. Полуколичественные методы анализа субстанций называются «просеивающими» или скрининг-тестами. Они позволяют осуществлять отбор больных с предполагаемыми наследственными или приобретенными дефектами обмена; их применяют при массовом обследовании больших контингентов детей для выявления наиболее распространенных и новых молекулярных болезней, при которых повышено выделение углеводов и продуктов их обмена. Эти вещества дают положительные реакции при проведении скрининг-тестов. В дальнейшем при выявлении молекулярной патологии проводится тщательное биохимическое обследование с помощью точных количественных методов.

Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче

Реактивы. Реактив Эрлиха^*, насыщенный раствор натрия ацетата; хлороформ; бутиловый спирт; бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0-5,0).

Оборудование. Пипетки на 5,0 и 10 мл; штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными пробирками.

Материал. Моча (подвергается исследованию в течение 2-3-х часов после мочеиспускания).

Метод основан на взаимодействии порфобилиногена с п-диметилами­нобензальдеги­дом с образованием соединения, окрашенного в красный цвет.

Ход определения. В пробирке смешивают 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают стеклянной палочкой. Затем измеряют рН индикаторной бумагой, значение рН должно быть в интервале 4,5-5,0, если рН меньше 4,0 добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН. Если окраска не образуется – результат отрицательный. При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым – результат отрицательный. При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6-8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро, в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой результат отрицательный, а если водная фаза остается окрашенной – результат положительный для порфобилиногена.

Примечание. При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре реакция может быть ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением порфобилиногена в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4˚С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0-7,0 порфобилиноген стабилен длительное время.

Оформление работы. Отметить характер развившегося окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данного определения.

Практическое значение работы. В норме порфобилиноген в моче не обнаруживается (0,2 мг/л). Данным методом он выявляется при концентрации, превышающей 6 мг/л ) при различных формах печеночных порфирий – острая перемежающая, копропротопорфирия, наследственная копропорфирия).