Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови

Реактивы. Хлорид кальция, 5 г/л раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1 и 5 мл.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на разной устойчивости отдельных белковых фракций сыворотки крови к коагуляции под действием определенных концентраций хлорида кальция и нагревания.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и 4,9 мл дистиллированной воды и перемешивают встряхиванием. К содержимому добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, пробирку встряхивают и осторожно нагревают раствор над пламенем до закипания. После этого пробирку охлаждают и смотрят на свет. Равномерное помутнение жидкости, независимо от его интенсивности, не свидетельствует об окончании реакции. Она завершается только при появлении хлопьев. Если же они не образуются, то вновь приливают в ту же пробирку 0,1 мл хлорида кальция, нагревают ее до закипания жидкости и так повторяют, пока не выпадет хлопьевидный осадок.

Отмечают объем хлорида кальция, пошедший на образование хлопьевидного осадка белков, и определяют состояние коагуляционной ленты Вельтмана по схеме

№ пробы	1	2	3	4	5	6			7	8		9	10
CaCl2	1,0	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5			0,4	0,3		0,2	0,1
Изменения	Сдвиг влево						Норма				Сдвиг вправо
Патология	Острые воспалительные и экссудативные состояния, опухоли										Повреждения печени, фиброзы, гемолиз, хронические воспалительные заболевания

Оформление работы. Отмечают объем хлорида кальция (в мл), пошедший на образование хлопьевидного осадка. В выводах указать изменения коагуляционной ленты Вельтмана.

Практическое значение работы. Нарушение соотношения белковых фракций крови (диспротеинемия) при ряде патологических процессов приводит к нарушению коллоидной устойчивости белков. Сдвиг коагуляционной ленты вправо (на образование хлопьевидного осадка пошло менее 0,4 мл CaCl₂), обусловленный повышением содержания γ-глобулинов в сыворотке крови, наблюдается при повреждении печени (гепатит, цирроз, дистрофия), гемолизе и хронических воспалительных процессах (пневмония, туберкулез, остеомиелит, пиелонефрит, ревматизм и др.). Сдвиг коагуляционной ленты влево (на образование хлопьевидного осадка пошло более 0,5 мл CaCl₂), обусловленный увеличением содержания сывороточных α- и β-глобулинов, отмечается при острых воспалительных и экссудативных процессах (ревматизм, туберкулез), сахарном диабете, поражении почек и злокачественных опухолях.

Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом

Реактивы. Крахмал, 20 г/л раствор; фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2; натрия хлорид, 30 г/л раствор; соляная кислота, 1 М раствор; иод, 0,1 М раствор в 30 г/л растворе иодида калия.

Оборудование. Водяная баня; термостат, отрегулированный на 37˚С; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; мерные колбы вместимостью 50 мл; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на фотометрическом определении убыли крахмала в ходе реакции гидролиза его α-амилазой сыворотки крови. Разница концентраций крахмала до и после гидролиза пропорциональна активности фермента.

Ход определения. В две пробирки, опытную и контрольную, вносят по 0,5 мл растворов крахмала, по 0,3 мл фосфатного буфера и по 0,1 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают на 10 мин в водяную баню при 37˚С.

В опытную пробу добавляют 0,1 мл сыворотки крови, а в контрольную – 0,1 мл раствора соляной кислоты и затем 0,1 мл сыворотки крови. Тщательно перемешивают смесь в пробирках и ставят пробы на 30 мин в термостат при 37˚С.

По окончании инкубации в опытную пробирку прибавляют 0,1 мл раствора соляной кислоты и быстро перемешивают содержимое встряхиванием– реакция останавливается.

Отбирают по 0,2 мл содержимого обеих пробирок и переносят в две мерные колбы на 50 мл. Приливают в них по 40 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл раствора иода в иодиде калия. Перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной воды.

Полученные растворы тотчас фотометрируют на ФЭКе против воды при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Примечание. Опытные и контрольные пробы должны иметь одинаковую температуру, так как ее изменение сказывается на интенсивности окраски иод-крахмального раствора.

Расчет проводят по формуле

(Е_к – Е_оп)0,01∙2∙1000

х = ——————————

Е_к0,1

где х – активность амилазы сыворотки крови, г/(ч∙л);

Е_к – экстинкция контрольной пробы;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

0,01 – масса крахмала в пробе, г;

2 – пересчет на 1 ч инкубации;

1000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,1 – объем сыворотки крови, взятой на исследование, мл.

Оформление работы. Рассчитать активность фермента, сравнить ее с нормой и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме активность амилазы сыворотки крови, определенная амилокластическим методом, составляет 15-30 г/(ч∙л). Источником сывороточной амилазы служат поджелудочная железа и слюнные железы. У здорового человека количество слюнной и панкреатической амилазы примерно одинаково. Возрастание активности амилазы крови (гиперамилаземия) наблюдается при остром панкреатите, когда она повышается в 10-30 раз, достигая максимума через 24 ч после начала заболевания, и затем постепенно приходит к норме на 2-6-й день. При хронических панкреатитах гиперамилаземия умеренная. Она встречается также при поражении слюнных желез. Гипоамилаземия отмечается при недостатке внешнесекреторной функции поджелудочной железы, заболеваниях печени (гепатит, цирроз, интоксикации), расстройствах питания (токсические диспепсии), сахарном диабете и т.д.