Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу

Реактивы. Гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив^*; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4^*; НАДФ·Н, 1 мМ раствор, свежеприготовленный; хлорид магния, 2,5 мкМ раствор; амидопирин, 80 мМ раствор; сульфат цинка, 25%-ный раствор; гидроксид бария, насыщенный раствор; реактив Наша^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1; 2 и 5 мл; спектрофотометр.

Материал. Взвесь микросом печени, полученная в работе 85, а.

Метод основан на измерении содержания в среде формальдегида, образующегося при окислительном N-деметилировании амидопирина в микросомах:

Формальдегид дает с реактивом Наша комплекс желтого цвета.

Ход определения. Проверяют содержание белка в микросомальной фракции, для чего помещают в пробирку 0,05 мл взвеси микросом, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива. Смесь перемешивают и через 30 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной (4 мл раствора NaOH и 0,2 мл биуретового реактива) на СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Экстинкции 0,30-0,60 примерно соответствует содержание белка 2-4 мг в 0,1 мл взвеси микросом. Если экстинкция выше, то необходимо взвесь микросом разбавить трис-буфером так, чтобы получилась нужная концентрация белка.

В опытную и контрольную пробирки вносят по 0,4 мл растворов трис-буфера и хлорида магния, по 0,2 мл НАДФ·Н и по 0,1 мл взвеси микросом. Перемешивают содержимое пробирок.

В опытную пробу добавляют 0,11 мл раствора амидопирина, а в контрольную – сначала по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария, а затем 0,11 мл амидопирина. Содержимое перемешивают.

Помещают обе пробирки на 20 мин в водяную баню при 37˚С, периодически встряхивая пробы. По окончании инкубации реакцию в опытной пробе останавливают, добавив по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария. Содержимое перемешивают.

Центрифугируют обе пробы при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Отбирают по 1 мл надосадочной жидкости в две другие пробирки и приливают в них по 2 мл реактива Наша. Ставят пробы на 45 мин в водяную баню при 37˚С.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на СФ при 412 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле:

аV1,71·333

х = —————————— ,

20·0,1·1000

где х – скорость N-деметилирования амидопирина, мкмоль/(мин·кг печени);

а – количество формальдегида, найденное по калибровочному графику (рис.12), нмоль;

V – объем взвеси микросом в трис-буфере, мл;

1,71 – объем инкубационной смеси, мл;

0,1 – объем взвеси микросом, взятый на исследование, мл;

20 – время инкубации, мин;

333 – коэффициент пересчета на 1 кг ткани печени;

1000 – коэффициент пересчета нмоль в мкмоль.

Оформление работы. Рассчитать скорость микросомального окисления амидопирина. В выводе указать на значение этого процесса.

Практическое значение работы. Исследование окисления ксенобиотиков монооксигеназной цепью микросом дает возможность оценить функцию этого процесса в норме и патологии, а также изучить особенности превращения различных соединений, токсичность и действие их продуктов на организм.