2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов

В клинико-биохимических лабораториях и фармации используются методы качественного и количественного анализа для определения гормонов, включая и гормоноиды, и медиаторов в биологическом материале и лекарствах. В то же время отклонения в содержании гормонально-медиаторных соединений регистрируют по нарушению регулируемых ими звеньев в обмене веществ.

Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.

Реактивы. Биуретовый реактив^*; нингидрин, 0,5%-ный водный раствор; гидроксид натрия, 20%-ный раствор; ацетат свинца, 5%-ный раствор.

Оборудование. Глазные пипетки; штатив с пробирками.

Материал.

1. Инсулин для инъекций.

2. Окситоцин для инъекций.

Принцип метода и ход определения см. работу 1, а, б, е.

Берут шесть пробирок и вносят в три из них по 5 капель инсулина, а в три другие – по 5 капель окситоцина. Проделывают с ними биуретовую, нингидриновую реакции и реакцию Фоля, как описано в работе 1, а, б, е.

Оформление работы. Данные занести в таблицу.

Препараты гормонов

Реакции

Выявляемая группа

Результат

В выводах отметить присутствие соответствующих групп и аминокислот в исследуемых гормональных препаратах.

Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот

Реактивы. Хлорид железа (III), 0,15 М раствор; сульфаниловая кислота, 1%-ный раствор; нитрит натрия, 5%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; гексацианоферрат (III) калия K₃[Fe(CN)₆] 0,2%-ный раствор; гидроксид натрия, 5 М раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; азотная кислота, конц.; иодат калия KIO₃, 1%-ный раствор; хлороформ.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; стеклянные палочки; водяная баня; флуороскоп.

Материал.

1. Адреналин, 0,1%-ный раствор в ампулах.

2. Тиреоидин, порошок.

а. Реакция на адреналин с хлоридом железа (III). Метод основан на способности пирокатехиновой группировки адреналина образовывать с хлоридом железа (III) комплексное соединение изумрудно-зеленого цвета:

Ход определения. В пробирку приливают 10 капель раствора адреналина и добавляют 1 каплю раствора хлорида железа (III). Наблюдают появление характерного окрашивания.

б. Реакция на адреналин с диазобензолсульфокислотой. Метод основан на способности адреналина образовывать с диазобензолсульфокислотой соединение красного цвета.

Ход определения. Для получения диазобензолсульфокислоты в пробирку наливают по 3 капли раствора сульфаниловой кислоты и нитрита натрия, перемешивают встряхиванием. Затем в пробирку добавляют 5 капель раствора адреналина и 3 капли раствора карбоната натрия. Содержимое перемешивают встряхиванием и наблюдают за развитием характерной окраски.

в. Обнаружение адреналина по образованию флуоресцирующего продукта его окисления – адренолютина. Метод основан на способности адреналина окисляться под действием K₃[Fe(CN)₆] в адренохром, из которого в щелочной среде образуется адренолютин, имеющий желто-зеленую флуоресценцию:

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 капле исходного раствора адреналина и добавляют в одну из них 5, а во вторую 10 мл воды. Перемешивают стеклянной палочкой.

В две другие пробирки отмеривают по 4 мл разведенных растворов адреналина, приливают по 0,3 мл раствора K₃[Fe(CN)₆] и оставляют стоять 5 мин (при этом адреналин окисляется в адренохром).

В каждую пробирку прибавляют на кончике скальпеля кристаллической аскорбиновой кислоты и по 4 мл раствора гидроксида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой (аскорбиновая кислота препятствует дальнейшему окислению адренохрома, а гидроксид натрия способствует превращению его в адренолютин).

Пробирки помещают в штатив флуороскопа и сравнивают интенсивность характерной флуоресценции в пробах.

г. Обнаружение иодтиронинов. Метод основан на отщеплении при кислотном гидролизе тиреоидных гормонов (иодтиронины) иодистоводородной кислоты

Иодтиронины HIO₃

(тироксин, HI + Продукты гидролиза

трииодтиронин) нагревание

при взаимодействии которой с иодатом калия выделяется свободный иод:

5HI + KIO₃ + HNO₃ → 3I₂ + KNO₃ + 3H₂O

В хлороформе иод имеет фиолетовую окраску.

Ход определения. В пробирку помещают несколько кристаллов тиреоидина, добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают 3-5 мин в кипящей водяной бане. Затем приливают 20 капель раствора иодата калия. Содержимое перемешивают и охлаждают.

В пробирку добавляют 15 капель хлороформа. Встряхивают и отмечают характерную окраску хлороформа.

Оформление работы. Данные занести в таблицу.

Исследуемый гормон

Реакция

Результат

В выводе отметить возможность практического использования этих реакций.