Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева

Реактивы. Сульфат меди (II), 0,01 М раствор; пероксид водорода, 6%-ный раствор; серная кислота, 6 М раствор; реактив Эрлиха (5%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в н-пропаноле или изопропаноле); гидроксид натрия, 2,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; стеклянные палочки; термостат; вода со льдом (или снегом) в стакане; водяная баня; ФЭК.

Материал. Моча, предварительно профильтрованная.

Метод основан на взаимодействии продукта окисления и декарбоксилирования гидроксипролина с n-диметиламинобензальдегидом, в результате чего образуется окрашенное соединение розового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации гидроксипролина в пробе.

Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл профильтрованной мочи, раствора сульфата меди (II), раствора гидроксида натрия и раствора пероксида водорода. Содержимое обеих пробирок перемешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин, затем их ставят в термостат при 70˚С на 5 мин, периодически встряхивая до полного прекращения выделения пузырьков. Затем пробы охлаждают в воде со льдом или снегом. К охлажденным пробам приливают по 4 мл раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха и перемешивают содержимое пробирок стеклянной палочкой. После этого опытную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 80 с, а контрольную – на то же время в воду со льдом или снегом.

Измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб против воды на ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 1 см. Из экстинкции опытной пробы вычитают экстинкцию контрольной пробы и полученную величину используют для нахождения содержания гидроксипролина в пробе по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика отмеривают в одну пробирку 1 мл воды («слепая» проба), а в пять других (стандартные пробы) – по 1 мл раствора гидроксипролина с концентрацией его 1, 10, 15, 20 и 25 мкг/мл.

Далее пробы обрабатывают так же, как и описанные выше опытные, измеряют экстинкцию стандартных проб против «слепой» при тех же условиях.

Расчет производят по формуле

ЕV

х = ————— ,

1000

где х – содержание гидроксипролина в моче, мг/сут;

Е – содержание гидроксипролина в пробе, найденное по калибровочному графику по разнице экстинкций опытной и контрольной проб, мкг;

V – суточный объем мочи, мл;

1000 – коэффициент пересчета микрограммов в миллиграмы.

Практическое значение работы. Гидроксипролин входит в состав только белков соединительной ткани – коллагена и эластина, в которых содержание данной аминокислоты составляет соответственно 10-15 и 1,5%. Выделение гидроксипролина с мочой, а также концентрация его в плазме или сыворотке крови зависит, в основном, от скорости синтеза коллагена, образования коллагеновых фибрилл и интенсивности распада коллагена в тканях.

В норме экскреция свободного гидроксипролина с мочой у взрослого человека составляет 1-8 мг, или 7,6-61,0 мкмоль в сутки. Повышенное выделение его с мочой отмечается при повреждении соединительной ткани, сопровождающемся распадом коллагена (например, при ревматизме, системной склеродермии, поражении костей и др.). Динамическое наблюдение за экскрецией гидроксипролина с мочой может дать информацию о формировании рубца в постинфарктном очаге миокарда.