Робота 7.8. Визначення концентрації гемоглобіну

Гемоглобін (Нв) – основна складова частина еритроцитів. За хімічною структурою він належить до хромопротеїдів і складається з білкової частини – глобіну і простетичної групи – гема, що містить залізо. Утворюючи з киснем нестійку і легкодисоціюючу сполуку – оксигемоглобін, гемоглобін є основним носієм кисню в тканинах. Біосинтез гемоглобіну відбувається в червоному кістковому мозку, частково в печінці та селезінці. В крові ембріонів і у молодих тварин міститься поряд з гемоглобіном дорослих і так званий фетальний гемоглобін. Вміст гемоглобіну залежить від виду, віку, статі і стану тварин. Основним методом визначення гемоглобіну є калориметричний. Рівень гемоглобіну вимірюється в г/л або одиницях Салі.

Мета роботи. Ознайомитися з калориметричним і фотометричним методами визначення вмісту гемоглобіну в крові тварин.

Матеріали і обладнання. Гемометр, капілярна піпетка на 20 мкл, 0,02 мл крові, піпетка для води, скляна паличка, децинормальний розчин НСl, дистильована вода, спирт, вата, флакон з-під пеніциліну, гемолізуюча рідина (0,04%-ний розчин аміаку або децинормальний розчин НСl), яка готується розведенням 1,6 мл 25%-ного (питома вага 0,91) розчину аміаку дистильованою водою до 1000 мл, електрофотокалориметр, фотоелектричний еритрогемометр.

Хід роботи

Визначення вмістуі гемоглобіну за методом Салі

Гемометр ГС-3 складається зі штатива з трьома гніздами. Задня стінка штатива являє собою пластинку з матового скла. В бокові гнізда вставлені однакові запаяні пробірки (кольорові стандарти). В середне гніздо вставлена градуйована пробірка для досліджуваної крові. На пробірку нанесена шкала, яка показує кількість гемоглобіну.

У градуйовану пробірку наливають децинормальний розчин НСl до нижньої колової позначки (0,2 мл). В капілярну піпетку набирають 0,02 мл крові. Кров, яка ще залишилась на кінчику капіляра, видаляють ваткою. Опускають капіляр на дно градуйованої пробірки і обережно видувають із нього кров так, щоб верхній шар розчину залишався прозорим. Потім два–три рази обережно промивають капіляр, набираючи розчин із верхнього прозорого шару. Виймають капіляр із пробірки, ретельно перемішують її вміст скляною паличкою і ставлять у штатив. Через

5 хв до розчину по краплях додають дистильовану воду і перемішують скляною паличкою до отримання однакового забарвлення зі стандартом. Поділка на шкалі, до якої піднялась рідина, покаже вміст гемоглобіну в грамах на літр.

Визначення рівняі гемоглобіну за допомогою фотоелектрокалориметра

Відмірюють 4 мл 0,04%-ного розчину аміаку в пеніциліновий флакон, потім піпеткою від гемометра беруть 20 мкл крові і виливають в цей розчин. Одержану пробу досліджують за допомогою ФЕК-М за зеленого світлофільтра в кюветі шириною 10 мм. Контролем є дистильована вода. За оптичною густиною за допомогою спеціальної таблиці визначають концентрацію (г/л) гемоглобіну в досліджуваній крові.

Геміглобінціанідний метод визначення гемоглобіну крові

Для визначення гемоглобіну крові геміглобінціанідним методом використовують набори реактивів фірм La hema, НПО “Реном”, НВП “Філісіт-Діагностика”. Принцип методу ґрунтується на тому, що гемоглобін у присутності окиснювача та ціаніданіонів утворює у водному розчині ціанметгемоглобін, забарвлення якого пропорційне вмісту гемоглобіну в крові. Даний метод рекомендують як стандартний.

Контрольні питання

1. Гемоглобін і його будова.

2. Сполуки гемоглобіну з газами, види та типи гемоглобіну.

3. Методи визначення гемоглобіну.

4. Рівень гемоглобіну в різних видів тварин.