хроми є компонентами дихального ланцюга мітохондрій та переносниками елек-

тронів від відновленого убіхінону на кисень. В цитохромній системі передавати електрони на кисень може лише цитохром а-а3 – цитохромоксидаза в склад якої входить мідь.

Метод визначення активності цитохромоксидази ґрунтується на здатності диметилпарафенілендіамінхлориду (ДПФД) бути донором електронів для цитохрому с.

ДПФД неферментативно відновлює цитохром с, а сам окислюючись, перетворюється на червоний пігмент, кількісне утворення якого є пропорційним активності цитохромоксидази мітохондрій.

Хід роботи. Дві пробірки: контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірка
	Контрольна	Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4	1,0 мл	1,0 мл
Розчин цитохрому с	2 краплі	2 краплі
Суспензія мітохондрій	0,5 мл	0,5 мл
Розчин ДПФД	0,5 мл	0,5 мл
Етиловий спирт	1,0 мл	---
Фізіологічний розчин	---	1,0 мл
Інкубація в термостаті 5 хв. при 37оС
Результати: поява червоного забарвлення

Додавання етилового спирту інактивує цитохромоксидазу та ферментативне пе-

ретворення цитохрому с. Пробірки поміщають в термостат на 5 хвилин при 37оС і спостерігають за появою червоного забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ТЕМА 12. ХЕМІОСМОТИЧНА ТЕОРІЯ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ. ІНГІБІТОРИ І РОЗ’ЄДНУВАЧІ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ.

Актуальність теми.

Мітохондріальну систему спряження окисних процесів з генерацією високоенергетичного інтермедіату АТФ, називають окисним фосфорилюванням.

Окисне фосфорилювання дозволяє організму поглинати значну частку потенцій-

но вільної енергії окислення субстратів. Обґрунтування механізму окисного фосфо-

рилювання дозволяє зробити хеміосмотична теорія. Окисне фосфорилювання є дуже важливим процесом, порушення перебігання його несумісно з життям.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Вивчити хеміосмотичну теорію окисного фосфорилювання та умови його ефе-

ктивного перебігу. Конкретні цілі:

1.Трактувати роль біохімічного окислення, тканинного дихання та окисного фосфо-

рилювання в генерації АТФ за аеробних умов.

2.Аналізувати порушення синтезу АТФ за умов дії на організм людини патогенних

факторів хімічного, фізичного та біологічного походження.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати особливості гістологічної будови мітохондрій та основи біоенергетики тканин.

25

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій				Вказівки до навчальних дій
1.	Практичне вивчення процесу			1.1. Дослідити процес окисного фосфори-
окисного		фосфорилювання в		лювання в мітохондріях, пояснити, на чому
мітохондріях.				він базується.
2.	Хеміосмотична теорія		окис-	2.1. Електрохімічний градієнт протонів
ного фосфорилювання – моле-				(ΔμН+). Фізико-хімічні складові електрохіміч-
кулярний		механізм генерації		ного градієнту протонів.
АТФ в процесі біологічного оки-
слення.
3.	Умови	ефективного	спря-	3.1. Цілісність мітохондріальної мембрани.
ження окислення та фосфори-				3.2. Наявність всіх компонентів ланцюга
лювання в мітохондріях.				транспорту.

3.3.Специфічна внутрішньомембранна топографія переносників.

3.4.Наявність достатньої кількості АДФ та

Рі.

4.Інгібітори та роз’єднувачі 4.1. Інгібітори транспорту електронів (роти-

тканинного дихання.	нон, амітал, ціаніди, СО).
	4.2. Роз’єднувачі окисного фосфорилювання
	(2,4-динітрофенол, гормони щитовидної за-
	лози, вільні жирні кислоти).
	4.3. Порушення синтезу АТФ в умовах дії на
	організм людини патогенних факторів хіміч-
	ного, фізичного та біологічного походження.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Огляд наукової літератури та підготовка реферативних повідомлень за темами:

1.Роз’єднувачі окисного фосфорилювання і регуляція термогенезу.

2.Універсальність хеміосмотичної теорії для живих систем.

Алгоритм лабораторної роботи.

Вивчення окисного фосфорилювання в мітохондріях та дії роз’єднувача – 2,4-динітрофенолу на цей процес.

Принцип методу. В процесі окислення різних субстратів і передачі електронів в

дихальному ланцюгу мітохондрій вивільняється енергія. Частина цієї енергії викори-

стовується для синтезу АТФ в процесі окисного фосфорилювання:

АДФ + Фн ® АТФ

В експерименті, щоб запобігти нагромадженню АТФ (високий вміст АТФ інгібує

ферменти дихального ланцюга) в якості кінцевого акцептора неорганічного фосфату використовують глюкозу. Фосфорилювання глюкози за участю АТФ каталізує фер-

мент – гексокіназа:

Глюкоза + АТФ ® АДФ + глюкозо-6-фосфат

Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності молібдату амонію в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням фосфату амонію. Фосфат амонію під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює про-

дукти забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилювання Фн вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Роз’єднувачі – це сполуки які порушують спряженість окислення і фосфорилювання в мітохондріях. В присутності роз’єднувачів спостерігається активне поглинан-

ня кисню мітохондріями, однак швидкість генерації АТФ – значно зменшується (або

відсутня). Згідно з хеміосмотичною теорією, роз’єднувачі спричиняють втрату мем-

26