Принцип методу: при нагріванні розчину білку, в якому є залишки сірковмісних

амінокислот (цистеїн) з розчинами лугу та солі свинцю, сірка утворює чорний осад

PbS.

Хід роботи: у пробірку налити 0,5 мл досліджуваного розчину, додати 1 мл реак-

тиву Фоля. Нагрівати на водяній бані до утворення чорного осаду.

2. Вивчення термолабільності ферментів.

Слину розвести у 5 разів (1 мл слини + 4 мл води). 2 мл розведеної слини

кип’ятити 5 хвилин. У 3 пробірки налити по 10 кап. 1% розчину крохмалю. У першу пробірку додати 10 кап. води (контроль), у другу – 10 кап. охолодженої прокип’яченої слини, у третю – 10 кап. розведеної слини.

Усі пробірки помістити у водяну баню або термостат при температурі 38 0С на 10

хвилин. Після цього виконати якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу (глюкозу та мальтозу).

Реакція на крохмаль: до 5 кап. досліджуваного розчину додати 1 кап. розчину

Люголю (КІ3). В присутності крохмалю з’являється синє забарвлення.

Реакція Фелінга: до 5 кап. досліджуваного розчину додати 3 кап. розчину Фелінга (CuSO4 + NaOH), підігріти. В присутності глюкози чи мальтози випадає жовтий осад

гідрату закису міді або червоний осад закису міді.

3. Вивчення залежності активності ферментів від рН середовища.

Слину розвести у 10 разів (1 мл слини + 9 мл води). В 3 пробірки налити по 1 мл

буферних розчинів з рН 3; 7,4; 14. В кожну пробірку відміряти по 1 мл розведеної слини, по 1 мл 1% розчину крохмалю, перемішати та інкубувати 10 хв. при температурі 38 0 С. Після цього під контролем індикаторного паперу нейтралізувати вміст пробірки з рН 3 - розчином лугу, а вміст пробірки з рН 14 – розчином 0,1н HCl.

Результат досліду виявити за допомогою розчину Люголя, додаючи його по 1-2 кап. в кожну пробірку, розмішати, відмітити забарвлення і зробити висновки.

ТЕМА 3. ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. ОДИНИЦІ ВИМІРУ КАТАЛІТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. ДОСЛІДЖЕННЯ ФЕРМЕНТНИХ ПРОЦЕСІВ ЗА ТИПОМ РЕАКЦІЙ ОСНОВНИХ КЛАСІВ ФЕРМЕНТІВ

Актуальність теми.

Кількісне визначення активності ферментів у біологічному матеріалі використову-

ється для діагностики різних хвороб. Так при гострому панкреатиті підвищується ак-

тивність амілази в крові та сечі.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Аналізувати зміну активності ферменту амілази в біологічних рідинах. Вивчення

міжнародної класифікації ферментів за типом реакцій. Конкретні цілі:

1.Кількісно визначати активність амілази в сечі за Вольгемутом, трактувати отримані результати.

2.Трактувати міжнародну класифікацію та номенклатуру ферментів за типом реакцій.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати поступовий гідроліз молекули крохмалю до мальтози через стадію декстринів. Знати типи хімічних реакцій.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

	Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1.	Практичне вивчення визна-	1.1. Визначення активності амілази слини.
чення амілази слини.
2.	Методи визначення активно-	2.1. На конкретних прикладах поясніть принципи
сті ферментів.		методів визначення активності ферментів:

12

	а) за кількістю продукту, який утворюється під
	дією ферменту за одиницю часу;
	б) за кількістю витраченого субстрату за одини-
	цю часу;
	в) спектрофотометричні методи визначення ак-
	тивності ферментів та візуалізація результатів
	ферментативної реакції.
	2.2. Одиниці виміру активності та кількості фер-
	ментів:
	а) міжнародні одиниці;
	б) катал;
	в) питома активність ферменту.
3. Міжнародна класифікація та 3.1. Пояснити принцип міжнародної класифікації
номенклатура ферментів за ти-	і номенклатури ферментів.
пом реакцій.	3.2. Назвати шість класів ферментів та поясни-
	ти типи каталізованих ними реакцій.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Зробити реферативну доповідь за темою: ”Роль підшлункової залози в виникненні гіперамілаземії і гіперамілазурії”.

Алгоритм лабораторної роботи.

Кількісне визначення активності амілази.

Принцип визначення активності амілази за Вольгемутом:

Метод заснований на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. Знаходять таке розведення слини, яке розщеплює 2 мг крохмалю (в 2 мл 0,1% роз-

чину крохмалю) за 30 хвилин при t=38 0С. Потім розраховують кількість крохмалю,

що розщеплюється 1 мл нерозведеної слини.

В нормі активність амілази слини – 160-320 ум.од. Хід роботи.

В 10 пробірок наливають по 1 мл води. В 1-у пробірку додають 1 мл слини, ро-

зведеної в 10 раз, перемішують. Набирають в піпетку 1 мл суміші і переносять її в 2-у

пробірку, їз неї – таким же чином у 3 -у і т.д. до 10 -ї пробірки. Із 10-ї пробірки 1 мл суміші виливають. У всі пробірки доливають по 1 мл води та по 2 мл крохмалю, перемішують і залишають у термостаті на 30 хвилин при t=38 0 С. Через 30 хвилин пробірки виймають і додають по 1 краплі розчину Люголю, перемішують. Рідина в

пробірках забарвлюється в жовтуватий, рожевий та фіолетовий кольори. Відмічають

останню пробірку з жовтим кольором, де гідроліз крохмалю пройшов повністю і проводять розрахунок.

Розрахунок:

Відмічають пробірку, де гідроліз крохмалю пройшов повністю. Наприклад, жовтий колір з’явився у 4-й пробірці, де слина розведена в 160 разів. Відповідно, 1/160 мл слини розщеплює 2 мл 0,1% розчину крохмалю, а 1 мл нерозведеної слини буде

розщеплювати Х мл 0,1% розчину крохмалю: 1/160 мл - 2 мл

1мл - Х мл

Х= 2 ´1´160 = 320 мл 0,1% розчину крохмалю.

1

Таким чином, амілазна активність слини дорівнює 320 ум.од.

13