роватками додають по 2 мл 2% -го розчину ацетилхоліну та інкубують при 37оС 10

хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1 М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення.

Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту. Заповнюють таблицю:

Досліджувана си-	Кількість 0,1 М NaOH, що пішла	Висновок
роватка	на титрування, в мл

№1

№2

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

ТЕМА 5. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕГУЛЯЦІЇ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ПРОЦЕСІВ.

Актуальність теми.

Перебіг біохімічних реакцій в організмі можливий лише за умов присутності ка-

талітично активних форм ферментів. Існує декілька шляхів регуляції активності ферментів: зміна каталітичної активності ферменту, зміна кількості ферменту. Завдяки

активації чи гальмуванню активності ферментів збільшується або зменшується

швидкість біохімічних реакцій, які лежать в основі процесів життєдіяльності. Порушення регуляції активності ферментів призводить до розвитку патологічних процесів

в організмі людини.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета: вивчити регуляцію ферментативних процесів. Конкpетні цілі:

1.Аналізувати механізми регуляції основних метаболічних процесів.

2.Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях.

Вихiдний piвень знань-вмiнь: знати властивості ферментів, їх будову, активні центри.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами учбової лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Змiст i послiдовнiсть дiй	Вказiвки до учбових дiй
1. Пpактичне вивчення специ-	1.1. В зошит протоколів дослідів виписати алго-
фiчності, гальмування та акти-	ритм лабораторної роботи.
вування ферментів.
2. Специфiчнiсть дiї феpментiв.	2.1. Пояснiть біологічну значимість специфiчності
	дiї феpментiв, чим вона обумовлена? Якi види
	специфiчностi феpментiв вiдомi Вам? Пpиведiть
	пpиклади.
3. Регуляція ферментативних	3.1. Регуляція активності ферментів шляхом зміни
процесів.	каталітичної активності ферменту:
	а) алостерична регуляція активності ферментів;
	б) ковалентна модифікація ферментів;
	в) активація ферментів шляхом обмеженого про-
	теолізу;
	г) дія регуляторних білків-ефекторів (кальмо-
	дуліну, протеїназ, протеїназних інгібіторів, цикліч-
	них нуклеотидів).
	3.2. Регуляція активності ферментів шляхом зміни
	кількості ферменту.
4. Інгібітори, активатори фер-	4.1. Зворотне і незворотне інгібування ферментів.
ментів.	4.2. Фізіологічно активні сполуки та ксенобіотики
	як зворотні (конкурентні та неконкурентні) та не-
	зворотні інгібітори ферментів.
5. Ізоферменти – множинні мо-	5.1. На прикладі ізоферментів лактатдегідрогенази
лекулярні форми білків, ре-	(ЛДГ), креатинфосфокінази поясніть значення їх
зультат експресії різних генів.	визначення в клініці.
	5.2. Проферменти, їх біологічна роль та значення.

15

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Підготувати реферативне повідомлення на тему: “Протеїнази. Протеїназні інгібі-

тори”.

Алгоритм лабораторної роботи. Специфічність ферментів.

1.Слину розвести у 5 разів ( 1 мл слини + 4 мл води). У 2 пробірки налити по 5

кап. розведеної слини. У першу пробірку долити 10 кап. 1% розчину крохмалю, у дру-

гу – 10 кап. 1% розчину сахарози. Обидві пробірки помістити на 10 хв. у термостат

при температурі 38 0С, після чого виконати реакцію Фелінга на вуглеводи.

Реакція Фелінга: до 5 кап. досліджуваної суміші додати 3 кап. розчину Фелінга

(CuSO4 + NaOH), підігріти. В присутності глюкози чи мальтози випадає жовтий осад

гідрату закису міді або червоний осад закису міді.

2.Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілізи слини.

В 3 пробірки налити по 1 мл слини, розведеної у 10 разів (1 мл слини + 9 мл в о- ди). У першу пробірку додати 1 кап. 1% розчину хлориду натрію, у другу – 1 кап. 1% розчину сірчанокислої міді, у третю – 1 кап. води, потім у кожну пробірку додати по 5

кап. 1% розчину крохмалю, перемішати і залишити при кімнатній температурі на 4-5 хвилин. Провести реакцію на крохмаль з реактивом Люголя (КІ3).

Реакція на крохмаль: до 5 кап. досліджуваної суміші додати 1 кап. розчину Люголя. В присутності крохмалю з’являється синє забарвлення.

3. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази. Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора –

ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка

розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься

специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін. Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами

холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними

отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії по-

лягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са2+ в нервовому закінчення є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщеплення

медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним

активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок				№ пробірки
		1		2	3
Сироватка крові, мл		0,5		0,5	0,5
Розчин CaCl2, крапель		---		5	---
Розчин фосфаколу, крапель		---		---	5
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
2%-ний розчин ацетилхоліну		1,5		1,5	1,5
	Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель	2			2	2

Кількість 0,1 М NaOH, що

пішла на титрування За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

16