ТЕМА 4. ДОСЛІДЖЕННЯ МЕХАНІЗМУ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ ТА КІНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛІЗУ.
Актуальність теми.
Складна будова та функціональна організація ферментів частково є ключем до
розуміння характерних властивостей ферментів – високої специфічності та швидкості каталізу. Велику роль у розвитку уявлень про механізм дії ферментів відіграли кла-
сичні роботи Міхаеліса і Ментен, які розробили положення про фермент-субстратні комплекси.
Мета та вихідний рівень знань.
Загальна мета.
Вивчення механізмів дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу. Знати
методи визначення активності ферментів, а також вміти інтерпретувати ці методи. Конкретні цілі:
1.Аналізувати механізми дії ферментів.
2.Пояснити методи визначення активності ферментів
3.Пояснити кінетику ферментативного каталізу.
Вихідний рівень знань-вмінь. Знати біологічну роль та структуру ферментів, фізико-
хімічні властивості білків.
Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.
Зміст і послідовність дій |
Вказівки до навчальних дій |
1.Практичне вивчення визна- 1.1. Визначення активності холінестерази.
чення активності холінестерази.
2.Механізми дії ферментів. 2.1. Термодинамічні закономірності фермента-
тивного каталізу.
2.2.Активні центри ферментів. Відмінності
будови активних центрів у простих та складних
ферментів.
2.3.Ферментативне перетворення субстратів
за каталітичної дії ферменту на прикладі дії хі-
мотрипсину та ацетилхолінестерази. Послідовність етапів каталітичного процесу.
3.Кінетика ферментативних 3.1. Залежність швидкості реакцій від концент-
реакцій. |
рації ферменту, субстрату, рН та температури. |
|
3.2. Константа Міхаеліса-Ментен, її смислове |
|
значення. |
Індивідуальна самостійна робота студентів.
Підготувати реферати з розділу «Механізм дії ферментів»:
А) механізм дії антиметаболітів на обмін речовин та їх клінічне застосування; В) механізм дії ферментів у вогнищі запалення.
Алгоритм лабораторної роботи.
Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).
Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утво-
ренням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише
ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.
Метод виявлення та кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кі-
лькість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.
Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5 мл сироватки крові № 1, у другу – 0,5 мл сироватки крові № 2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними си-
14