2. Визначення активності амінотрансфераз.

Принцип методу. Амінотрансферази – ферменті які вміщують у якості коферментів фосфопірідоксамін, каналізують зворотній перенос аміногруп з амінокислот на α – кетокислоти. Визначення концентрації α – кетокислот, які утворюються при трансамі-

нуванні лежить в основі дінітрофенілгідразінового методу визначення активності трансаміназ.

Техніка роботи. Визначення аспартатамінотрансферази (АсАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АсАТ, витримують у термостаті при t =37оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t

=37оС 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH,

перемішують та залишають на 10 хвилин.

Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються при λ = 560нм. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ). В пробірку вносять 0,5

мл субстратно-буферної суміші для визначення АлАТ, витримують у термостаті при t =37оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37оС 30 хви-

лин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідрозіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин. Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються.

Контрольні проби обробляють так, як дослідні, але сироватку додають після інкубації проб.

Розрахунок активності ферментів проводять по калібровочному графіку. При бу-

дові калібровочного графіку на осі ординат відкладають значення оптичної щільності,

а на осі абсцис вміст ПВК.

Фізіологічні рівні: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при t =37оС.

ТЕМА 25. БІОСИНТЕЗ ГЛУТАТІОНУ ТА КРЕАТИНУ

Актуальність теми.

Креатинін – це кінцевий продукт обміну креатинфосфату тканин. Підвищена екскреція із сечею креатиніну спостерігається у хворих з лихоманкою, гострими інфекціями, при цукровому діабеті. Креатинін – азотистий шлак, але завдяки азотвидільній функції нирок кров від нього очищається. При патології нирок, що супроводжується

порушенням азотвидільної функції, а також при гострій серцевій недостатності, креа-

тинін накопичується в крові, а виділення його із сечею знижується. Тому кількісне визначення креатиніну в крові та сечі є одним із обов’язкових аналізів при хворобах нирок. Креатинфосфат застосовують в клініці для лікування хворих з серцево-судинною

недостатністю.

Мета та вихідний рівень знань

Загальна мета.

Засвоїти метод кількісного визначення креатиніну в сечі, вміти оцінити результа-

ти аналізу. Знати кольорову реакцію на креатин з пікриновою кислотою, вміти розраховувати результат аналізу.

Конкретні цілі:

1.Пояснювати біохімічні механізми утворення креатину та креатиніну.

2.Аналізувати клінічне значення порушень обміну креатину та креатиніну.

3.Трактувати роль глутатіону в обміні органічних пероксидів.

Вихідний рівень знань-вмінь: вміти писати будову амінокислот – попередників синтезу креатину та глутатіону.

45

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне значення ви-	1.1. Визначення креатиніну в сечі.
значення креатиніну в сечі.

2.Обмін креатину. 2.1. Біологічна роль креатин-фосфату.

2.2.Біосинтез креатину.

2.2.1.Попередники біосинтезу креатину.

2.2.2.Особливості другого етапу біосинтезу креатину

– трансметилювання глікоціаміну (гуанидинацетату).

Джерела СН3–груп.

2.3. Реакція фосфорилювання креатину.

3.Клініко-біохімічне значен- 3.1. Клінічне значення визначення вмісту креатину та

ня порушень обміну креакреатиніну в крові та сечі.

тину.	3.2. Клінічне значення визначення креатинфосфокі-
	нази. Ізоформи креатинфосфокінази.
4. Глутатіон.	4.1. Попередники біосинтезу глутатіону.
	4.2. Роль глутатіону в обміні органічних пероксидів.

Індивідуальна самостійна робота студентів. Підготувати реферат на тему:

1.Сучасні біохімічні методи дослідження функції нирок.

2.Біологічна роль системи глутатіона в антиоксидантному захисті.

Алгоритм лабораторної роботи.

Кільнісне визначення креатиніну в сечі.

Принцип методу: креатинін при взаємодії з пікриновою кислотою у лужному середовищі створює забарвлені сполуки, інтенсивність забарвлення яких пропорційна концентрації креатиніну в сечі.

Екскреція креатиніну: ♂- 1,0-2,0 г/доб

♀- 0,8-1,8 г/доб

Хід роботи:

У колбу об’ємом 100 мл наливають 1 мл сечі, 1 мл NaOH, 1,5 мл розчину пікри-

нової кислоти, перемішують і залишають на 10 хвилин. Потім доводять об’єм до 100 мл дист. водою. Паралельно виконують контроль: 1 мл Н2О, 1 мл NaOH, 1,5 мл пікринової кислоти, перемішують та доводять об’єм до 100 мл дист. водою.

Фотометрують проти контролю на ФЕК з зеленим світлофільтром у кюветі на

5мм. За допомогою калібровочного графіку визначають кількість креатиніну в 1 мл

сечі і перераховують його кількість у сечі за добу (1500-2000).

Калібровочний графік кількісного визначення креатиніну у 1 мл сечі.

Е

0,25

0,20

0,15

0,10

0,5 1,0

1,5

2,0

С, мг/мл

46