Тема 8. Методы посева бактерий на питательные среды (8.1), их культивирование (8.2), выделение чистых культур бактерий (8.3)
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Овладеть техникой посева бактерий на питательные среды, ознакомить с методами их культивирования, освоить методы и приемы выделения чистой культуры бактерий.
МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Пробирки со смесью бактерий разных видов (стафилококк, вакцинный штамм сибиреязвенной палочки, кишечной палочки). Питательные среды в пробирках: МПБ, скошенный МПА (по числу студентов), МПА (столбиком), среда Эндо, солевой МПА, чашки Петри. Бактериологические петли, шпатели. Предметные стекла, спиртовки, набор красок для окрашивания по Граму. Водяная баня на 100°С. Термостат.
8.1. Техника посевов бактерий на питательные среды
При первичных посевах из исследуемого материала или посева из чистых культур бактерий на питательные среды необходимо соблюдать строгую стерильность, чтобы не занести посторонних микробов. Все работы по посевам и пересевам бактерий проводятся в специальных помещениях (в боксах). Инструментами для посева и рассева микроорганизмов служат бактериологические петли, иглы, шпатель (рис. 22).
При посеве бактерий на питательные среды или пересеве из одной пробирки в другую соблюдают следующий порядок. Вначале в пламени горелки стерилизуют петлю и петледержатель, который при посеве входит в пробирку. Пробирку с чистой культурой со стерильной скошенной средой берут в левую руку в наклонном положении так, чтобы пробирка с культурой была первой по отношению к работающему. В правую руку берут, как писчее перо, петлю и, держа ее вертикально, прокаливают в пламени горелки. Ватные пробки захватывают мизинцем правой руки, вынимают и держат их во время посева в таком положении. Ни в коем случае не допускается класть пробки на стол. Обжигают края открытых пробирок в пламени горелки и вводят стерильную петлю в пробирку с культурой. Петлю охлаждают о внутреннюю стенку пробирки, прикасаются к участку незасеянного агара и, если он не плавится, прикасаются к поверхности культуры бактерий. Пробирку слегка отодвигают от пламени, предохраняя материал от сжигания. Быстро, но осторожно, переносят петлю в пробирку со стерильной средой, опускают, до конденсационной воды, и зигзагообразными движениями распределяют материал по скошенной поверхности агара. Извлекают петлю, обжигают края пробирок и вставляют обожженные пробки, затем стерилизуют петлю (рис. 23).
Рис. 22. Инструменты для посева и пересева микробов:
1 – бактериологическая петля;
2 – бактериологическая игла;
3 – шпатель
Рис. 23. Пересев из одной пробирки в другую
Посев на плотные среды в чашках Петри проводят бактериологической петлей или стеклянным шпателем. Крышка чашки с агаровой средой приподнимается левой рукой, но полностью не открывается, наносится капля исследуемого материала и растирается на поверхности среды (рис. 24).
Рис. 24. Посев шпателем в чашку Петри с плотной питательной средой
При посеве уколом пробирку с агаром или желатином (среда разлита в виде столбика) держат дном вверх или под углом. Посев производят бактериологической иглой, которой прокалывают питательную среду до дна (рис. 25). Посев уколом в столбик применяется для выращивания анаэробов, выявления протеолитических свойств, а также с целью длительного хранения культур.
Для посева в жидкие среды пользуются петлей, стерильными градуированными или пастеровскими пипетками. Техника посева на жидкие среды петлей аналогична технике посева на скошенный агар, но материал на петле растирают по стенке пробирки и смывают питательной средой.
При пользовании пастеровской пипеткой кончик капилляра отламывается прокаленным пинцетом, пипетку проводят через пламя. На другой конец пипетки надевают резиновый баллончик и опускают ее в пробирку с жидким исследуемым материалом. Небольшое количество материала набирают путем легкого нажатия на баллончик и переносят материал в пробирку с незасеянной питательной средой, выдувая его с помощью груши.
После посева пастеровские пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.
Рис. 25. Посев уколом в агар столбиком