Тема 11. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Методы: серийных разведений (11.1), диффузии в агар (11.2)

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Овладеть методами определения чувствительности и устойчивости бактерий к антибиотикам.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Выделенные на предыдущем занятии чистые культуры бактерий, взвесь кала на физиологическом растворе. Для демонстрации: набор антибиотиков, ряд пробирок с МПБ, содержащим серийно разведенный пенициллин и засеянный культурой стафилококка. Стерильные чашки Петри, расплавленный МПА (столбиком), мерные и пастеровские пипетки, пинцеты, спиртовки, стандартные диски с разными антибиотиками. Таблицы, схемы, рисунки.

Антибиотики – это лекарственные препараты, обладающие антимикробным действием. Они получили широкое применение для терапии многих болезней животных и человека. С каждым годом расширяется арсенал антибиотических препаратов, выпускаемых промышленностью. Источником получения антибиотиков являются микроскопические грибы (пенициллин), актиномицеты (стрептомицин, тетрациклин), бактерии (грамицидин, полимиксин). Антибиотические вещества извлекают и из клеток растений (фитонциды лука, чеснока) и животных тканей (лизоцим, экмолин).

Механизм антагонистического действия антибиотиков сводится к нарушению процессов обмена веществ в микробной клетке.

Антибиотики могут оказывать на микроорганизмы бактериостатическое и бактерицидное действия. При бактериостатическом действии антибиотиков подавляет или задерживает рост микроорганизмов, а бактерицидное — вызывает их гибель.

Создание большого количества разнообразных антибиотиков вызвано, с одной стороны, поисками все более эффективных лечебных средств, а с другой, тем, что по мере широкого применения антибиотиков их лечебный эффект снижается вследствие возникновения резистентных (устойчивых) форм микробов.

Эффективность применения антибиотиков во многом зависит от чувствительности возбудителя болезни к применяемому антибиотику, поэтому возникла необходимость определения чувствительности микроорганизмов к этим препаратам.

При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя, и лишь при необходимости срочного получения ответа используют исследоуемый материал, содержащий всю микрофлору.

В лабораторной практике для определения чувствительности бактерий к антибиотикам используют следующие методы.

11.1. Методы серийных разведений

Более точные результаты можно получить, применяя метод серийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 2 мл из этой пробирки в следующую и т.д. до девятой пробирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для постановки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикетках которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500 000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД/мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД/мл, во второй 25 ЕД/мл и т.д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.

Если порошок антибиотика расфасован не мерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20-25 мг), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т.е. получить раствор мг/мл, в 1 мл которого содержится столько единиц, сколько их было указано па этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив концентрацию взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10 000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0,2 мл вносят во все пробирки ряда, начиная с контрольной. Таким образом, во всех пробирках определяют рост после инкубации при 37 °С в течение 18-20 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную концентрацию антибиотика, подавляющую рост данного микроорганизма.

Таблица 2