13.2. Определение вирулентности микробов

При изучении свойств патогенных микробов в ряде случаев производят определение их вирулентности. Это необходимо для идентификации микробов, выделенных от больных, носителей и из внешней среды, характеристики силы вакцины, выявление напряженности иммунитета у животных и т.д.

Вирулентность микробов выражается МLD – минимальной смертельной дозой, то есть минимальным количеством микробов, вызывающих гибель животного определенного вида, и LD50 – дозой, вызывающей гибель 50 % зараженных животных.

Определение МLD. Для этой цели пользуются культурами, выращенными на плотных или жидких питательных средах. Культуры на плотных питательных средах смывают 0,85%-ным раствором поваренной соли и устанавливают определенное количество микробных тел в 1 мл, пользуясь оптическим стандартом. Культуры, выращенные на жидких питательных средах, разводят то или иное количество раз. Минимальная смертельная доза может резко варьировать в зависимости от вида и штамма микроба, а также вида животного, места введения и других факторов. Например, для определения вирулентности возбудителя пастереллеза; 18-часовую агаровую культуру Р. multocida смывают физиологическим раствором и устанавливают содержание микробов по оптическому стандарту до 1 млрд. в 1 мл.

В первый ряд пробирок наливают пипеткой 1,8 мл физиологического раствора.

Затем в первую пробирку вносят 0,2 мл из основного разведения культуры микроба, получая разведение 500 млн. микробных тел.

Далее делают разведение 250, 125, 62,5 млн/мл и т.д., каждое разведение готовят отдельной стерильной пипеткой.

Содержимое каждой пробирки вводят подкожно белым мышам массой 18-20 г.

За животными наблюдают в течение 10 дней, отмечая погибших животных. Минимальное количество микробов, вызвавшее гибель белой мыши, принимается за МLD.

Определение LD50. В настоящее время этот метод определения вирулентности микробов более достоверный и менее зависит от индивидуальной чувствительности животного.

Из культуры бактерий или вирусов делают десятикратные разведения. Каждое разведение вводят нескольким животным.

Очень трудно подобрать такое разведение, которое вызывало бы гибель 50 % животных, поэтому в настоящее время применяется метод статистического учета и исчисления LD50, предложенный Л. Ридом и X. Менчем. При исследовании материала, разведенного от 10^-1 до 10^-8, потребуется 8 групп животных. После прекращения наблюдения отмечают количество погибших животных в каждой группе и определяют LD50 при помощи специальных таблиц.

Проведение дермонекротической пробы.

Она применяется для выявления некротоксина, содержащегося в фильтрате бульонной культуры.

Для этого у кролика белой масти на боковой поверхности выбривают участок кожи и дезинфицируют, внутрикожно вводят 0,2 мл исследуемого материала. При положительной пробе вначале отмечают гиперемию, затем отек и в последнюю очередь некроз (обычно через 2 – 3 дня).

13.3. Бактериологическое исследование трупа

Основной целью бактериологического исследования трупа является обнаружение микроба, вызвавшего гибель животного, выделение его в чистой культуре и определение места локализации возбудителя.

При вскрытии трупа животного необходимо соблюдать ряд условий.

1. Вскрытие следует производить как можно быстрее после гибели животного, так как кишечная флора быстро проникает в ткани, кровь, органы. При комнатной температуре это происходит через 10-18 часов, а при температуре холодильника – через 20-22 часа. Труп до вскрытия сохраняют на холоде.

2. Вскрытие трупа, взятие материала для исследования производят с соблюдением правил асептики. Инструменты используют только стерильные и меняют при вскрытии каждой полости или каждого органа.

3. Необходимо исключить возможность заражения работающих и загрязнение окружающих предметов. Перед вскрытием трупы мелких животных погружают в дезинфицирующий раствор, у более крупных животных шерсть увлажняют этим раствором. Вскрывают трупы на хорошо выстроганной окрашенной доске, помещенной в металлическую ванночку или кювету с дезинфицирующим раствором. После окончания вскрытия труп уничтожают.

4. Все данные вскрытия обязательно протоколируют. Записи должны быть подробными и четкими. В протоколе отмечают дату заражения и описание материала, которым производили заражение.

Порядок вскрытия. Труп кладут спиной на доску, растягивают в стороны лапы и фиксируют препаровальными иглами или острыми гвоздями (рис. 39). До фиксирования производят осмотр трупа. Отмечают изменение наружных покровов, выпадение шерсти и изменение цвета кожи (при злокачественном отеке и т.п.).

Перед вскрытием инструменты переносят из стерилизатора в банку со спиртом и ватой на дне, перед употреблением их обжигают в пламени.

Вскрытие наружных покровов. Вскрытие начинают с продольного разреза кожи от нижней челюсти до лобка. Отсепарируют ее по сторонам, делают надрезы по направлению к конечностям и откидывают в стороны лоскутки кожи, обнажая всю переднюю поверхность. Отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. Если последние изменены, делают посевы на питательные среды и препараты-отпечатки (методом разреза прикасаются к предметному стеклу). Использованные инструменты погружают в дезинфицирующий раствор.

Вскрытие грудной полости. Обжигают спиртом вскрытую поверхность (протирают спиртом и поджигают его). Пинцетом захватывают мечевидный отросток, делают поперечный разрез под ним и два продольных, перерезая ребра в местах их соединения с хрящами. Лоскут в виде треугольника (основание у диафрагмы, а вершина у ключиц) откидывают вверх и изучают органы грудной клетки, отмечают наличие экссудата, производят посев крови и делают препараты-отпечатки из ткани легких. Кровь из сердца берут пастеровской пипеткой. Предварительно разрезают сердечную сорочку и прижигают поверхность мышцы сердца, прикладывая раскаленный скальпель.

Капилляр пипетки вводят в область желудочка или предсердия через прижженное место, кровь сама поступает в капилляр, после чего пипетку извлекают, кровь сеют на питательные среды, а из остатка делают мазки.

Вскрытие брюшной полости. Осторожно, чтобы не захватить петлю кишки, приподнимают пинцетом брюшную стенку, делают ножницами разрез диафрагмы до лобка и два поперечных. Отвернув мышечные лоскуты, исследуют органы брюшной полости, обращая внимание на величину, цвет и консистенцию селезенки, печени, надпочечников. Обязательно производят посевы из тканей селезенки, печени, мезентериальных лимфатических узлов и экссудата. Материал для посева берут петлей. Поверхность органа прижигают раскаленным скальпелем и производят разрез в этом участке; петлей делают соскоб в месте разреза и сеют на питательные среды. Для приготовления мазков вырезают небольшой кусочек ткани, берут его пинцетом и прикасаются к поверхности предметного стекла местом среза (препарат-отпечаток) или распределяют тонким слоем.

Рис. 39. Вскрытие трупа белой мыши

Труп животного после вскрытия сжигают, автоклавируют или кипятят в течение одного-двух часов в карболовом растворе. Все инструменты стерилизуют в автоклаве под давлением или кипячением в стерилизаторе.

Задания для самостоятельной работы

1. Заразить лабораторных животных (белые мыши, морские свинки, кролики) различными способами: подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно. В качестве материала для введения использовать стерильный физиологический раствор.

2. Вскрыть труп белой мыши, погибшей от заражения вакцинным штаммом возбудителя сибирской язвы (II вакцина Ценковского)

3. Приготовить мазки-отпечатки из органов, окраска по Граму на капсулу, провести микроскопию. Посев из внутренних органов на МПА и МПБ.

4. Занести в бланк-экспертизу данные по заражению, вскрытию и исследованию трупа животного.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. С какой целью проводят заражение лабораторных животных?

2. Какие виды лабораторных животных используют для экспериментального заражения?

3. Какие методы используют для заражения животных?

4. В каких условных единицах измеряют вирулентность микроорганизмов?

5. Раскрыть сущность метода бактериологического исследования трупа животного.