2.2. Виды микроскопии и их назначение
Для микробиологических исследований используют различные виды микроскопии: световую, люминесцентную, темнопольную, фазово-контрастную, электронную.
Наиболее распространенным методом является световая (оптическая) микроскопия.
В настоящее время отечественная промышленность выпускает самые разнообразные биологические микроскопы: МБИ-1, -2, -3, -4 (микроскоп биологический исследовательский), МБР (рабочий), люминесцентные микроскопы (МЛ-1, МЛ-2), электронные.
При микроскопировании изучают морфологию микроорганизмов, их тинкториальные свойства (отношение к красителям), а также структурные особенности (споры, капсулы), подвижность и др.
Микроскопия с фазово-контрастным устройством. С помощью фазово-контрастного устройства различия в фазе световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Метод фазового контраста позволяет увидеть прозрачные объекты более четко (контрастно), но не увеличивает разрешающей способности микроскопа (рис.3). Основная ценность этого метода состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты без их фиксации и окрашивания.
Рис. 3. Фазово-контрастное устройство: А – общий вид; Б – принципиальная схема работы фазово-контрастного микроскопа
Рис. 4. Микроскопия в темном поле: А – внешний вид темнопольного конденсора ОИ-13; Б – принципиальная схема светового микроскопа с темнопольным конденсором
Фазово-контрастное устройство представляет собой приставку к микроскопу и состоит из специальных фазовых объективов, дающих различное увеличение, конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из которых соответствует определенному объективу, и вспомогательного микроскопа. Все фазовые объективы имеют на оправе букву «Ф».
Микроскопия в темном поле. Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света (рис. 4). Лучи не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит микроорганизмы, то косые лучи в определенной степени отражаются от их поверхности и, отклоняясь от своего первоначального направления, попадают в объектив. В этом случае на интенсивно черном поле видны ослепительно яркие светящиеся объекты. Такое освещение достигается применением специального темнопольного конденсора, имеющего затемненную среднюю часть. Поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора.
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты за пределами видимости обычного микроскопа. Однако наблюдение объектов в темном поле позволяет различить только их контуры и не дает возможности рассмотреть внутреннее строение.
Люминесцентная микроскопия. Люминесцентный микроскоп состоит из сильного источника ультрафиолетового света, светофильтров и биологического микроскопа (рис. 5) Между источником света и зеркалом микроскопа устанавливается сине-фиолетовый фильтр. Лучи света с короткой волной, попадая на препарат, возбуждают в нем свечение. На окуляр микроскопа ставят желтый фильтр, который отсекает сине-фиолетовые лучи и пропускает длинноволновые лучи, видимые глазом. В люминесцентной микроскопии большое значение имеет иммунофлюоресцентный метод с использованием специфических люминесцентных сывороток.
Рис. 5. Люминесцентный микроскоп МЛ-2:
а – общий вид; б – схема: 1 – основание микроскопа; 2 – тубусодержатель; 3 – предметный столик; 4 – кронштейн с конденсором; 5 – электропульт ПРЛ-5; 6 – рукоятка полевой диафрагмы; 7 – рукоятка для переключения освещения; 8 – револьверный диск с «запирающими» светофильтрами; 9 – рукоятка включения ахроматической линзы; 10 – револьвер объективов; 11 – светофильтры в оправах; 12 – винты для центровки лампы; 13 – рукоятка перемещения коллектора; 14 – рукоятка полевой диафрагмы; 15 – крышка гнезда светофильтров; 16 – винты для центрировки полевой диафрагмы; 17 – макрометрический винт; 18 – микрометрический винт; 19 – оправа коллектора; 20 – коробка с механизмами грубого и тонкого перемещения препарата; 21 – винт для крепления насадки; 22 – винты для центрировки полевой диафрагмы; 23 – бинокулярная насадка; 24 – рукоятка тормоза грубого движения; 25 – рукоятка для переключения освещения; 26 – рукоятка для перемещения препарата в горизонтальной плоскости; 27 – защитная втулка: 28 – корпус ртутной лампы; 29 – кювета с дистиллированной водой
Их приготовление основано на способности некоторых флюорохромов, например изоцианат флюоресцеина, вступать в химическую связь с сывороточными белками без нарушения их иммунологической специфичности.
При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические антитела, связавшиеся с микробными антигенами, образуют комплексы, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов. При непрямом методе вначале антиген обрабатывают гомологичными нефлюоресцирующими антителами, образуется комплекс антиген - антитело, для обнаружения которого применяют флюоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного продуцента гомологичных антител. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя животных глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антимикробных антител.
Электронная микроскопия. Электронная микроскопия делает возможным наблюдение объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
В электронных микроскопах световые лучи заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа, практически составляющая 0,1-0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1 000 000 раз (рис. 6).
Наряду с приборами «просвечивающего» типа, используют «сканирующие» электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая способность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов «просвечивающего» типа.
Рис. 6. Электронный микроскоп: А — внешний вид; Б — принципиальная схема электронного микроскопа
Задания для самостоятельной работы
1. Изучить устройство микроскопа, освоить правила работы с ним.
2. Провести просмотр готовых окрашенных препаратов-мазков. Микроскопическую картину зарисовать.
3. В ходе работы уяснить значение конденсора, диафрагмы и других оптических частей микроскопа. С этой целью провести микроскопию: а) без конденсора и с опущенным конденсором с использованием объективов х8, х40, х90 и окуляров х7, х10, х15; б) с прикрытой диафрагмой.
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Иммерсионный масляный объектив от других объективов отличается: А. Черной полосой.
Б. Белой полосой.
В. Цифрой х90.
Г. Цифрой х40.
2. При микроскопии окрашенного препарата, приготовленного из культуры стафилококка, диаметр которого 1 мкм, получено изображение диаметром 0,9 мм. Определить, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?
А. х90 и х7.
Б. х90 и х10.
В. х90 и х15.
Г. х40 и х15.
3. При микроскопии окрашенного препарата, приготовленного из культуры кишечной палочки, истинная длина которой 5 мкм, получено изображение палочки длиной около 4,5 мм.
Определить, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?
А. х90 и х7.
Б. х90 и х10.
В. х90 и х15.
Г. х40 и х15.
4. При микроскопии препарата с объективом х90 и окуляром х10 получено нерезкое изображение.
Найти ошибку, которая была допущена при проведении микроскопии.
А. Конденсор не поднят до конца.
Б. Микроскопия проводится без масла.
В. Использовано вогнутое зеркало.
5. При микроскопии препарата с использованием объектива х90 и окуляра х10 выявлена слабая освещенность поля зрения.
Ваши действия по устранению этого недостатка:
А. Поднять конденсор до уровня предметного столика.
Б. Проверить и открыть диафрагму конденсора.
В. Нанести на препарат иммерсионное масло.
6. Размеры бактерии измеряются в микрометрах (мкм), один мкм составляет:
А. 1/10 мм.
Б. 1/100 мм.
В. 1/1000 мм.
7. Структурные образования бактериальной клетки измеряются нанометрах (нм), один нм составляет:
А. 1/10 мкм.
Б. 1/100 мкм.
В. 1/1000 мкм.
8. Завершив микроскопию с использованием иммерсионной системы, необходимо сделать:
А. Поднять макровинтом тубус из масла и убрать препарат.
Б. Убрать препарат, поднять тубус микроскопа макровинтом.
9. После работы с микроскопом с использованием иммерсионной системы необходимо сделать:
А. Макровинтом поднять тубус, убрать препарат, салфеткой снять с объектива масло, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.
Б. Убрать препарат, макровинтом поднять тубус, снять с объектива масло, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.
В. Макровинтом поднять тубус, убрать препарат, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.
10. При микроскопии препарата с иммерсионным объективом допущена ошибка, которая привела к получению нерезкого изображения. Найдите способ исправления ошибки.
А. Нанести на препарат иммерсионное масло.
Б. Вращать макровинт.
В. Вращать микровинт на полоборота в ту или иную сторону.
11. Установлено, что стафилококки при микроскопировании имеют диаметр, равный 1,35 мм, в действительности этот микроорганизм имеет диаметр, равный 1 мкм. Определите, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?
А. Объектив х40, окуляр х15.
Б. Объектив х90, окуляр х7.
В. Объектив х90, окуляр х10.
Г. Объектив х90, окуляр х15.
12. Конденсор микроскопа предназначен для:
А. Уменьшения светового потока.
Б. Фокусирования световых лучей на плоскости рассматриваемого объекта.
В. Увеличения изображения объекта.
13. Микровинт микроскопа предназначен для:
А. Фокусировки при работе с объективом х40.
Б. Фокусировки при работе с объективом х90.
В. Перемещения препарата при микроскопии при работе с объективом х90.
14. При работе с микроскопом при увеличении х90 микровинт не вращается. Ваши действия по восстановлению работы микровинта:
А. Микровинт вращать в обратную сторону, добиваясь положения белой точки на середине между двумя белыми линиями.
Б. Поднять макровинтом объектив х90 из масла, вращая микровинт в обратную сторону, добиться положения белой точки на середине между двумя белыми линиями.
В. Обратиться за помощью к преподавателю.