Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Освоить сущность полимеразной цепной реакции, ознакомиться с компонентами и методом ее постановки.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Набор компонентов для постановки ПЦР, приборы - амплификатор, аппарат для электрофореза, трансиллюминатор.

ПЦР, разработанная в последние годы, находит все большее использование в микробиологии. С помощью этой реакции можно быстро и надежно провести диагностику инфекционных болезней животных и человека путем индикации возбудителя в исследуемом материале на генетическом уровне.

Вначале из патологического материала или микробной культуры методом щелочного гидролиза выделяют ДНК-образца. С ДНК-образца проводят полимеразную цепную реакцию, т.е. амплификацию заданного фрагмента ДНК-гена. При этом происходит образование дополнительных копий гена в пробирке заданного участка ДНК-образца. Для этого в пробирку с ДНК-образца вносят основные компоненты: праймер (затравку), трифосфаты, ДНК-полимеразу. Праймер представляет собой олигонуклеотид, состоящий из 15-20 нуклеотидов. Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе «Виктория», пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК определенного вида микроорганизма.

Смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dGTR, dATP, dCTP, dTTP) – дезоксигуанин, - аденин, цитозин, тимин, трифосфорная кислота. ДНК-полимераза - фермент, способный использовать полинуклеотиды как матрицы и строить комплиментарные им новые нуклеотидные цепи.

Пробирки помещают в амплификатор-прибор, который позволяет поддерживать строго заданный температурный режим, и осуществлять полимеразную цепную реакцию.

Сущность ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, то есть нагреванию до 90-94°С, что ведет к денатурации – разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали, а затем охлаждают (отжиг) до 52°С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. Последующее повышение температуры до 70-72°С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру (плавления, отжига и синтеза ДНК) повторяют многократно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается.

Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК-амплификата в количестве, достаточном для дальнейшего исследования или индикации. Индикация производится с помощью электрофореза или с помощью меченого ДНК-зонда.

Методика постановки полимеразной реакции

1. Получение ДНК-образца (лизатов, исследуемого материала). Для этого исследуемый материал суспензируют в буфере или дистиллированной воде, добавляют 1 М раствор NаОН и выдерживают при 37°С 6-7 мин. Смесь нейтрализуют добавлением трис-(оксицетил)аминометана (рН=6,0). Лизат центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК и РНК, используют для постановки ПЦР.

2. Проведение полимеразной цепной реакции – амплификация данного фрагмента (ДНК-гена). Для этого вносят буферный раствор (буфер для ПЦР (10х)-500 mM КСl, 100 mМ трис-НСl рН – 8, 14, 15 mМ МgС1, 0,1 % желатина или бычьего сывороточного альбумина), фермент ДНК-полимеразу, праймер – олигонуклеотид-затравку, трифосфаты – предшественники синтеза ДНК, исследуемый образец ДНК или биологическая жидкость – кровь, моча, слюна, мокрота и т.д.

3. В пробирку емкостью 1,5 мл (эппендорф) собирают смесь, состоящую из:

125 мкл бидистиллированной стерильной воды,

15 мкл буфера для ПЦР,

5 мкл раствора трифосфатов,

3 мкл раствора праймера,

3 мкл раствора ДНК-полимеразы термостойкой.

Смесь разливают в 5 пробирок (емкостью 0,5 мл) по 30 мкл. В каждую из них вносят по 0,5-1,0 мкл надосадочной жидкости из лизата, перемешивают, сверху наслаивают по 25 мкл стерильного вазелинового масла. Включают амплификатор и устанавливают режим работы:

плавления - 92°С в течение 60 с;

отжиг ДНК - 55°С в течение 60 с;

синтез ДНК - 70°С в течение 75 с.

В стадии плавления пробирки устанавливают в амплификатор; проводят 80 циклов амплификации, что занимает 3 часа времени, и за этот срок из одной молекулы ДНК образуется до 1 млн молекул-копий. Реакцию останавливают на стадии «синтеза» и в этой стадии выдерживают 3-5 мин для окончательного досинтезирования фрагментов ДНК.

Полученные пробы молекул ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле. Для этого готовят 1,7%-ный раствор агарозы с этидий бромидом (краситель), разливают на подложку и устанавливают пластинку с зубцами для образования лунок. Через 10-15 мин агароза полимеризуется (застывает).

Пластинку с зубцами осторожно снимают, при этом на агарозе образуются лунки. В аппарат для электрофореза заливают буфер и устанавливают электроды.

В полученные в агарозе лунки вносят пробы:

1) амплификат;

2) праймер (свидетель);

3) лизат, полученный из исследуемого материала.

Электрофорез проводят в режиме 4-5 V/см. Через 40-50 мин аппарат отключают, вынимают пластинку с агарозой и 10 мин окрашивают в 1,7%-ном растворе этидия бромида. Агарозную пластинку помещают на трансиллюминатор, освещают ультрафиолетовыми лучами и фотографируют.

Полосы в агарозной пластинке, выявляемые при ультрафиолетовом освещении, являются фрагментами ДНК, синтезированные в процессе амплификации со специфическим для каждого возбудителя праймером.

На электрофореграмме выявляют расположение полос, которое зависит от электрофоретической подвижности компонентов реакции. Положительной реакцией считают расположение полос на электрофореграмме на одном и том же уровне, что указывает на идентичность амплификанта и праймера. При отрицательных пробах и контроле совпадение полос не происходит или они отсутствуют.

Задание для самостоятельной работы

1. Ознакомиться с оборудованием, приборами, компонентами, реактивами, используемыми для постановки ПЦР.

2. Провести фрагментально постановку ПЦР.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Охарактеризуйте структуру ДНК.

2. В чем сущность принципа комплементарности ДНК?

3. Преимущества ПЦР при диагностике инфекционных болезней по сравнению с другими методами.