22.1. Постановка реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом

В качестве примера приводим постановку РА на бруцеллез с сывороткой крови крупного рогатого скота.

Реакция ставится в объеме 1 мл жидкости. Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками; автоматическими пипетками Флоринского, одиночными (рис. 63) или групповыми (рис. 64).

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок, поставленных в первый ряд. Количество таких рядов зависит от числа исследуемых сывороток. В первой пробирке каждого ряда готовят основное разведение 1:25. Для этого к 2,4 мл физиологического раствора вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки. После приготовления основного разведения сывороток в остальные 4 пробирки, кроме 2-й, каждого ряда разливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из первой пробирки из разведения 1:25 вносят 0,5 мл во вторую пробирку, получая разведение 1:50. Из этого разведения готовят разведение 1:100, перенося из одной пробирки 0,5 мл жидкости. Методом последовательного разведения готовят разведение 1:200 и 1: 400. Из последней пробирки (1:400) излишек жидкости 0,5 мл удаляют (рис. 65).

Рис. 63. Одиночная автоматическая пипетка Флоринского: а - стеклянный патрубок; б - расширение для сбора избыточной жидкости; в - резиновая груша; г — пипетка-мерник

Рис. 64. Групповая автоматическая пипетка Флоринского: а - стеклянный цилиндр; б - отверстие в нижней части цилиндра; в - пипетки-мерники; г - приемник для избыточной жидкости; д — отверстие для слива избыточной жидкости; е -резиновая груша

Во все пробирки, кроме первой, вносят по 0,5 мл антигена, разведенного 1:10

Рис. 65. Схема постановки реакции агглютинации пробирочным методом

Таким образом получают ряд из четырех исследуемых пробирок с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 в объеме 0,5 мл.

Во все пробирки каждого ряда, кроме первой (1:25), вносят по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного 1:10 физиологическим раствором. Первая пробирка с сывороткой в разведении 1:25 без антигена служит контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты агглютинации не учитываются.

При постановке РА одновременно с исследуемыми сыворотками ставят контроля:

- с негативной (отрицательной) сывороткой в тех разведениях, как с исследуемыми;

- с позитивной (положительной) сывороткой в разведениях до ее предельного титра;

- контроль антигена (0,5 мл физиологического раствора с 0,5 мл разведенного антигена) для исключения спонтанной агглютинации.

После розлива всех компонентов штативы с пробирками осторожно стряхивают и помещают в термостат при 37-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

Результаты реакции учитывают визуально и определяют ее степень в плюсах по следующей схеме (рис. 66).

Рис. 66. Реакция агглютинации при постановке пробирочным методом: 1 и 2 отрицательные; 3 и 4 - положительные

(++++) – полное просветление жидкости, на дне осадок в виде «зонтика», при легком встряхивании осадок разбивается на мелкие зерна, а жидкость остается прозрачной (100%-ная агглютинация);

(+++) – неполное просветление жидкости, «зонтик» хорошо выражен, при встряхивании – мелкие зерна (75%-ная агглютинация);

(++) – незначительное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен, при встряхивании мелкие зерна (50%-ная агглютинация);

(+) – едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество зерен (25%-ная агглютинация);

(–) – просветление жидкости, образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки видна «пуговка» осевших микробов, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два плюса (++).

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крупного рогатого скота с оценкой не менее чем два плюса (++) в разведении 1:100 и выше.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 с сыворотками крупного рогатого скота с оценкой не менее чем на два (++).

Для определения природы антител в исследуемом материале предложено несколько модификаций проведения реакции агглютинации.