- •Министерство сельского хозяйства
- •Раздел I. Общая микробиология
- •Бактериологическая диагностика
- •1.2. Техника безопасности при работе в ветеринарной лаборатории
- •1.3. Общая схема проведения бактериологической диагностики
- •1.4. Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала
- •Сопроводительное письмо на патологический материал
- •Задания для самостоятельной работы
- •2.1. Устройство оптического микроскопа.
- •2.2. Виды микроскопии и их назначение
- •Тема 3. Техника приготовления препаратов для микроскопии (3.1). Бактериологические краски (3.2). Простой метод окрашивания препаратов (3.3). Изучение основных форм бактерий (3.4)
- •3.1. Техника приготовления препаратов для микроскопии
- •3.2. Бактериологические краски
- •3.3. Простой метод окрашивания препарата для микроскопии
- •3.4. Основные формы бактерий
- •Задания для самостоятельной работы
- •Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
- •Тема 4. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий (4.1). Окраска по Граму (4.2)
- •4.1. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий
- •4.2. Окрашивание по Граму
- •Задания для самостоятельной работы
- •Тема 5. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий: окраска спор (5.1) и капсул (5.2)
- •5.1. Окраска спор
- •5.2. Окраска капсул
- •Тема 6. Назначение и классификация питательных сред для бактерий (6.1) и их приготовление (6.2)
- •6.1. Назначение и классификация питательных сред
- •Классификация питательных сред
- •6. 2. Приготовление питательных сред
- •Тема 7. Стерилизация. Методы: физические (7.1), химические (7.2), механические (7.3)
- •7.1. Физические методы
- •7.2. Химические методы
- •7.3. Механические методы
- •Тема 8. Методы посева бактерий на питательные среды (8.1), их культивирование (8.2), выделение чистых культур бактерий (8.3)
- •8.1. Техника посевов бактерий на питательные среды
- •8.2. Методы культивирования бактерий
- •8.3. Методы выделения чистых культур бактерий
- •Тема 9. Культуральные свойства бактерий на плотных (9.1) и в жидких (9.2) питательных средах
- •9.1. Культуральные свойства бактерий на плотных питательных средах
- •9.2. Культуральные свойства бактерий в жидких питательных средах
- •Тема 10. Ферментативные (биохимические) свойства бактерий
- •1. Определение ферментации углеводов
- •2. Определение протеолитических свойств
- •3. Определение редуцирующей (восстанавливающей) способности
- •Тема 11. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Методы: серийных разведений (11.1), диффузии в агар (11.2)
- •11.1. Методы серийных разведений
- •Критерии оценки чувствительности стафилококков к пенициллину
- •11.2. Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков)
- •Тема 12. Исследование бактерий на подвижность
- •В. Биологические методы исследований
- •Тема 13. Методы заражения лабораторных животных (13.1). Определение вирулентности микроорганизмов (13.2). Бактериологическое исследование трупа животного (13.3)
- •13.1. Методы заражения лабораторных животных
- •13.2. Определение вирулентности микробов
- •13.3. Бактериологическое исследование трупа
- •Тема 14. Культивирование анаэробных микроорганизмов
- •Тема 15. Методы изучения микроскопических грибов и ак-тиномицетов
- •Тема 16. Методы изучения риккетсий (16.1), хламидий (16.2) и микоплазм (16.3)
- •16.1. Методы изучения риккетсий
- •16.2. Методы изучения хламидий
- •16.3. Методы изучения микоплазм
- •Раздел II. Основы санитарной микробиологии
- •Тема 17. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха (17.1) и почвы (17.2)
- •17.2. Санитарно-микробиологическое исследование почвы
- •Санитарно-бактериологические показатели почвы
- •Тема 18. Санитарно-микробиологическое исследование воды
- •Тема 19. Подведение итогов санитарно-микробиологического исследования воздуха, почвы и воды (19.1). Санитарно-микробиологическое исследование мяса (19.2)
- •19.1. Методы количественного определения микробов в исследуемых объектах
- •19.2. Санитарно-микробиологическое исследование мяса
- •Тема 20. Санитарно-микробиологическое исследование молока (20.1) и кисломолочных продуктов (20.2)
- •Классификация молока по редуктазе
- •Показатели бактериальной чистоты питьевого молока
- •20.2. Санитарно-микробиологическое исследование кисломолочных продуктов
- •Раздел III. Серологическая диагностика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных
- •Тема 21. Реакция преципитации: кольцепреципитации (21.1), диск-преципитации (21.2), диффузионной преципитации (21.3)
- •21.1. Реакция кольцепреципитации
- •21.2. Реакция диск-преципитации
- •21.3. Реакция диффузионной преципитации (рдп)
- •Тема 22. Реакция агглютинации: пробирочный метод (22.1). Другие модификации постановки реакции (22.2)
- •22.1. Постановка реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом
- •22.2. Другие модификации постановки реакции. Кольцевая реакция с молоком (кр)
- •Тема 23. Реакция связывания комплемента (рск)
- •Главный опыт рск
- •Задания для самостоятельной работы (для трех занятий)
- •Тема 24. Методы люминесцентной микроскопии
- •Тема 25. Иммуноферментный метод (ифм) диагностики инфекционных болезней
- •Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)
- •Тема 27. Использование в микробиологии днк-зондов
- •Раздел IV. Специальная (частная) микробиология
- •Тема 28. Патогенные стафилококки.
- •Тема 29. Патогенные стрептококки
- •Тема 30. Возбудители эшерихиозов
- •Тема 31. Возбудители сальмонеллезов
- •Тема 32. Возбудитель листериоза
- •Тема 33. Возбудитель рожи свиней
- •Тема 34. Возбудитель антропозоонозной чумы
- •Тема 35. Возбудители гемофилезов
- •Тема 36. Возбудитель пастереллеза
- •Тема 37. Возбудитель туляремии
- •Тема 38. Возбудитель бруцеллеза
- •Тема 39. Возбудитель сибирской язвы
- •Тема 40. Патогенные анаэробы – возбудители эмфизематозного карбункула (40.1), злокачественного отека (40.2), брадзота овец (40.3), инфекционной анаэробной энтеротоксемии (40.4)
- •40.1. Возбудитель эмфизематозного карбункула (эмкара)
- •40.2. Возбудители злокачественного отека
- •40.3. Возбудитель брадзота овец
- •40.4. Возбудитель инфекционной анаэробной энтеротоксемии
- •Тема 41. Патогенные анаэробы – возбудители столбняка (41.1), ботулизма (41.2), некробактериоза (41.3), копытной гнили (41.4)
- •41.1. Возбудитель столбняка
- •41.2. Возбудитель ботулизма
- •41.3. Возбудитель некробактериоза (фузобактериоза)
- •41.4. Возбудитель копытной гнили
- •Тема 42. Возбудители туберкулеза (42.1) и паратуберкулеза (42.2)
- •42.1. Возбудитель туберкулеза
- •42.2. Возбудитель паратуберкулеза
- •Тема 43. Возбудитель актиномикоза
- •Тема 44. Возбудитель сапа
- •Тема 45. Возбудитель лептоспироза
- •Тема 46. Возбудитель кампилобактериоза (вибриоза)
- •Тема 47. Возбудитель дизентерии свиней
- •Тема 48. Возбудители микоплазмозов
- •Тема 49. Возбудители риккетсиозов
- •Тема 50. Возбудители хламидиозов
- •Тема 51. Возбудители микозов
- •Тема 52. Возбудители микотоксикозов
- •Задания для програмированного контроля знаний студентов по частной ветеринарной микробиологии
- •Ответы на задания для программированного контроля по разделу «Частная микробиология»
- •Оглавление
Тема 15. Методы изучения микроскопических грибов и ак-тиномицетов
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Ознакомить и освоить технику микологических исследований. Изучить морфологию грибов, дрожжей, дрожжеподобных грибов и актиномицетов.
МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Готовые препараты, приготовленные из микроскопических грибов и актиномицетов, чистые культуры грибов на питательных средах, препаровальные иглы, микологические крючки, предметные и покровные стекла, 50%-ный водный раствор глицерина, раствор метиленовой сини, спиртовки, микроскопы; схемы, таблицы.
Грибы (Fungi) – низшие растения, характеризуются следующими свойствами: широко представлены в природе, не имеют хлорофилла, наличие у большинства видов вегетативных органов гиф, которые, переплетаясь, образуют мицелий. Они относятся к аэробам, по типу питания – метатрофы, нетребовательны к условиям внешней среды.
Значение микроскопических грибов (плесени) в патологии сводится к тому, что они могут вызывать различные болезни, а их токсины массовые отравления у животных и человека.
Болезни, вызываемые патогенными грибами у человека и животных, называют микозами.
К микозам относятся дерматомикозы: стригущий лишай (трихофития, микроспория), парша; бластомикозы, кандидамикозы, аспергиллезы и др.
Болезни, возникающие при поедании животными кормов, пораженных различными видами токсических грибов, называют микотоксикозами. К ним относятся фузариотоксикоз, аспергиллотоксикоз, дендродохиотоксикоз, клавицепстоксикоз и др. Патогенные и токсигенные грибы относятся к классам: зигомицеты, аскомицеты, базидомицеты, дейтеромицеты. Они отличаются друг от друга по типу мицелия, по наличию и строению органов плодоношения, по типу спор и другим признакам.
При морфологическом изучении у грибов устанавливают вегетативное тело, которое у большинства грибов состоит из тонких ветвящихся нитей – гиф, образующих сплетение – мицелий.
По строению мицелия грибы подразделяются на низшие и высшие.
У низших грибов (фикомицеты) гифы не септированы и они представляют собой одну гигантскую клетку с многочисленными ядрами без перегородок.
У высших грибов (микомицеты) гифы имеют перегородки, разделяющие их на отдельные одноядерные или многоядерные клетки, называемые септами (рис. 43).
Рис. 43. Строение мицелий у микроскопических грибов: А — фикомицеты (мицелий не септирован); Б- микомицеты (мицелий септирован)
Другая группа грибов не образует мицелия – дрожжи, дрожжеподобные клетки, одноклеточные организмы, относящиеся к классу аскомицетов (сумчатые грибы).
Размножение грибов происходит двумя способами: вегетативным и репродуктивным. К последнему относится бесполое и половое размножение.
Вегетативное размножение может происходить за счет случайно оторвавшейся части мицелия.
Часть мицелия может превращаться в оидии (артроспоры), дающие начало новой грибнице. На более высших ступенях развития грибов на мицелии могут появляться хламидоспоры, которые отличаются от оидий более толстой оболочкой.
У дрожжей очень часто при размножении происходит простое деление клеток, которые остаются связанными вместе (почкование).
Репродуктивное размножение происходит с помощью спор, которые образуются бесполым и половым путем. Фикомицеты размножаются половым и бесполым путем. У микомицетов преобладает бесполое размножение.
Наиболее распространено бесполое размножение с помощью, спор, развивающихся на особых ответвлениях мицелия (спорангиеносцев), имеющих структуру мешков-спорангиев, в которых формируются споры (эндоспоры), характерные для низших мукоровых грибов, У грибов аскомицетов спорангии называют асками, а споры – аскоспорами.
Экзогенные споры – конидии – образуются на концевых участках особых гиф – конидиеносцы, которые могут быть простыми или разветвленными. У аспергиллов кониединосец на конце имеет округлое вздутие, на поверхности которого сплошным слоем расположены клетки в один или два ряда – стеригмы.
Микологическая диагностика сводится к:
1) микроскопии первичного исследуемого материала;
2) выделению чистой культуры возбудителя с использованием специальных питательных сред и определению его родовой и видовой принадлежности;
3) определению патогенных и токсигенных свойств на биологических моделях.
При микозах в лабораторию направляют соскобы с кожи с захватом волос на границе со здоровой тканью, соскобы со слизистых оболочек ротовой полости, молоко, трупы птиц и мелких животных и др.
При микотоксикозах направляют пробы кормов (солома, сено, зернофураж, комбикорм, отруби и др.), рвотные массы, от трупов – желудок, кишечник с содержимым, паренхиматозные органы и др.
Для микроскопического исследования на дерматоксикозы патологический материал предварительно обрабатывают 10-20%-ным раствором NаОН или КОН в течение 15-20 мин. Небольшое его количество препаровальной иглой или глазным пинцетом переносят на предметное стекло, добавляют 50%-ный водный раствор глицерина и накрывают покровным стеклом.
Микроскопию препарата «раздавленная капля» проводят под световым микроскопом с использованием объективов х8 и х40 в затемненном поле зрения (с прикрытой диафрагмой конденсора).
Морфологическая картина в препаратах, приготовленных из патологического материала, представлена: при трихофитии – мицелий не разветвлен, гифы и споры лежат правильными рядами вдоль волоса, при микроспории гифы и споры, по отношению к волосу, располагаются беспорядочно.
Для выделения чистой культуры микроскопических грибов проводят посевы на специальные питательные среды: сусло-агар, Сабуро, Чапека и др.
В состав суслового агара входит неохмеленное пивное сусло и 2 % агар-агара, среда Сабуро включает в себя глюкозу, пептон и агар-агар, среда Чапека – глюкозу, набор минеральных солей и агар-агар.
Посевы культивируют в термостате при 25-30°С.
Рост грибов на средах появляется на 7-10-й день.
При определении рода и вида грибов изучаются их морфологические особенности в динамике на питательных средах при соответствующих условиях. С этой целью колонии грибов, выросших на средах, микроскопируют под стереоскопическим или обычным микроскопом с объективом х8. Далее готовят препараты «раздавленная капля». Для этого препаровальными иглами или микологическим крючком отделяют небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему слоем питательной среды, переносят на предметное стекло в каплю 50%-ного водного раствора глицерина и придавливают покровным стеклом. Такие неокрашенные препараты микроскопируют как обычно.
Для выявления дрожжей и дрожжеподобных организмов готовят препараты для микроскопии, фиксируют физическим или химическим методами, окрашивают раствором метиленовой сини и микроскопируют.
Особенности строения некоторых низших и высших микроскопических грибов характеризуются следующими признаками.
Мукоровые грибы, или головчатая плесень (Mucor), относятся к фикомицетам – грибам с ветвящимся одноклеточным, пушистым, серовато-сизого цвета мицелием (рис. 44, 1).
В мицелии отсутствуют перегородки. Из мицелия поднимаются вверх спорангии в виде головок, которые содержат эндоспоры.
Пенициллиум, или кистевидная плесень (Penicillium), - род плесени, имеющий большое количество видов. В верхней части конидиеносец разветвлен и формирует кисть из стеригм с цепочками конидий на них (экзоспоры) (рис 44, 2).
Аспергилл, или леечная плесень (Aspergillus), обладает многоклеточным мицелием. На конце плодоносящей мицелиальной нити выступают округлые или булавовидные образования, от которых отходят в радиальном направлении короткие отростки – стеригмы, на конце последних экзоспоры (рис. 44, 3).
Фузариум (Fusarium) – плесень, обладающая мицелием, окрашенным в зависимости от вида гриба в различный цвет (желтый, коричневый и др.). Образует конидии серповидные: одноклеточные – микроконидии, многоклеточные – макроконидии. Гриб может образовывать также хламидоспоры (рис. 44, 5).
Стахиоботрис (Stachyobotrys) – мицелий септирован, многоклеточный, от которого вверх поднимаются споросные гифы конидиеносцы со стеригмами и сидящими на них конидиями. Конидиеносцы бесцветные, гладкие, в верхней части бородавчатые, оливко-бурого цвета (рис. 44, 4).
Рис. 44. Конидии и конидиеносцы у различных родов микроскопических грибов: 1 –Mucor; 2 – Penicillium; 3 – Aspergillus; 4 – Stachyobotrys; 5 – Fusarium
Дрожжевые грибы представляют собой крупные клетки овально-шаровидной формы. Они не образуют мицелия и размножаются различными путями: почкованием, делением, половым путем и эндоспорами, которые располагаются в особых сумках (асках) и называются аскоспорами (рис. 45).
Рис. 45. Дрожжевые грибы
Дрожжеподобные грибы не образуют истинного мицелия. Однако при размножении их клетки располагаются цепочками, вытягиваются в длинные нити, которые называют псевдомицелием.
Для определения токсичности грибов готовят экстракт из пораженного корма и выросшей культуры. Экстрагируют эфиром (можно ацетоном или хлороформом) в аппарате Сокслета или стеклянной банке с притертой крышкой. Экстракт выпаривают в водяной бане при 45-50°С под тягой. Токсичность определяют алиментарно (скармливанием) или постановкой кожной пробы.
Алиментарную пробу проводят на белых мышах, морских свинках, кроликах, цыплятах путем скармливания им исследуемого корма или вытяжки в течение трех дней.
Кожная проба ставится на кроликах. Для этого на свежевыбритый участок (размером 4-5 см2) втирают экстракт. В положительном случае через 1-3 дня отмечается гиперемия, отечность и далее некроз. Биопробу можно проводить на куриных эмбрионах, аквариумных рыбках, парамециях.
Актиномицеты (лучистые грибы) имеют сходное строение с микроскопическими грибами. Тело их представляет собой одну, очень разветвленную клетку (мицелий), которая состоит из цитоплазмы, недифференцированного ядра и оболочки. Толщина ветвящихся нитей мицелия – гиф – незначительна: от 0,2 до 1,2 мкм, длина может достигать нескольких десятков микрометров (рис. 46). На плотной питательной среде они образуют плотные колонии, врастающие в среду, которые сверху имеют конидиеносцы со спорами в виде мучнистого налета.
Учитывая особенности роста актиномицетов, мазки готовят следующим образом. Препаровальной иглой отделяют небольшой участок мицелия и помещают в каплю глицерина, затем покрывают его покровным стеклом и слегка прижимая, раздавливают мицелий. готовые препараты микроскопируют под малым и средним увеличением микроскопа с прикрытой диафрагмой.
Рис. 46. Морфология актиномицетов: 1 - мицелий; 2 - спорангии
Из патологического материала готовят обычным способом мазки, окрашивают простым методом и по Граму. Микроскопируют иммерсионным объективом.
Патогенные актиномицеты вызывают у животных и у человека болезнь, которая называется актиномикоз.
В организме больных животных актиномицеты образуют друзы – мелкие желтовато-белого цвета зерна (рис. 47).
Друзы извлекают из гноя петлей и помещают в каплю глицерина на предметное стекло, слегка придавливают покровным стеклом и вводят каплю раствора метиленовой сини. Микроскопию проводят объективами х8 и х40.
В центре друзы обнаруживают густое сплетение укороченных нитей с лучеобразно отходящими гифами, колбовидно утолщенными на концах. Окрашиваются актиномицеты метиленовой синью в бледно-голубой цвет, элементы гноя – в интенсивно синий цвет.
Рис. 47. Друзы Actinomyces bovis
Задания для самостоятельной работы
1. Приготовить препараты «раздавленная» капля для микроскопии из культур грибов, дрожжей и актиномицетов.
2. Провести микроскопию и изучить морфологические особенности грибов, дрожжей и актиномицетов. Зарисовать микрокартину.
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Морфологические особенности микроскопических грибов. Перечислить основные отличительные признаки различных родов грибов.
2. Объяснить значение терминов: гифы, мицелий, плодоносящие гифы, спорангиеносец, конидии, споры, оидии, хламидоспоры.
3. Как происходит размножение грибов, дрожжей, дрожжеподобных грибов и актиномицетов.
4. Морфологические особенности дрожжей и дрожжеподобных грибов. Чем они отличаются между собой и от бактерий?
5. Морфологические особенности актиномицетов.