- •Министерство сельского хозяйства
- •Раздел I. Общая микробиология
- •Бактериологическая диагностика
- •1.2. Техника безопасности при работе в ветеринарной лаборатории
- •1.3. Общая схема проведения бактериологической диагностики
- •1.4. Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала
- •Сопроводительное письмо на патологический материал
- •Задания для самостоятельной работы
- •2.1. Устройство оптического микроскопа.
- •2.2. Виды микроскопии и их назначение
- •Тема 3. Техника приготовления препаратов для микроскопии (3.1). Бактериологические краски (3.2). Простой метод окрашивания препаратов (3.3). Изучение основных форм бактерий (3.4)
- •3.1. Техника приготовления препаратов для микроскопии
- •3.2. Бактериологические краски
- •3.3. Простой метод окрашивания препарата для микроскопии
- •3.4. Основные формы бактерий
- •Задания для самостоятельной работы
- •Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
- •Тема 4. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий (4.1). Окраска по Граму (4.2)
- •4.1. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий
- •4.2. Окрашивание по Граму
- •Задания для самостоятельной работы
- •Тема 5. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий: окраска спор (5.1) и капсул (5.2)
- •5.1. Окраска спор
- •5.2. Окраска капсул
- •Тема 6. Назначение и классификация питательных сред для бактерий (6.1) и их приготовление (6.2)
- •6.1. Назначение и классификация питательных сред
- •Классификация питательных сред
- •6. 2. Приготовление питательных сред
- •Тема 7. Стерилизация. Методы: физические (7.1), химические (7.2), механические (7.3)
- •7.1. Физические методы
- •7.2. Химические методы
- •7.3. Механические методы
- •Тема 8. Методы посева бактерий на питательные среды (8.1), их культивирование (8.2), выделение чистых культур бактерий (8.3)
- •8.1. Техника посевов бактерий на питательные среды
- •8.2. Методы культивирования бактерий
- •8.3. Методы выделения чистых культур бактерий
- •Тема 9. Культуральные свойства бактерий на плотных (9.1) и в жидких (9.2) питательных средах
- •9.1. Культуральные свойства бактерий на плотных питательных средах
- •9.2. Культуральные свойства бактерий в жидких питательных средах
- •Тема 10. Ферментативные (биохимические) свойства бактерий
- •1. Определение ферментации углеводов
- •2. Определение протеолитических свойств
- •3. Определение редуцирующей (восстанавливающей) способности
- •Тема 11. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Методы: серийных разведений (11.1), диффузии в агар (11.2)
- •11.1. Методы серийных разведений
- •Критерии оценки чувствительности стафилококков к пенициллину
- •11.2. Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков)
- •Тема 12. Исследование бактерий на подвижность
- •В. Биологические методы исследований
- •Тема 13. Методы заражения лабораторных животных (13.1). Определение вирулентности микроорганизмов (13.2). Бактериологическое исследование трупа животного (13.3)
- •13.1. Методы заражения лабораторных животных
- •13.2. Определение вирулентности микробов
- •13.3. Бактериологическое исследование трупа
- •Тема 14. Культивирование анаэробных микроорганизмов
- •Тема 15. Методы изучения микроскопических грибов и ак-тиномицетов
- •Тема 16. Методы изучения риккетсий (16.1), хламидий (16.2) и микоплазм (16.3)
- •16.1. Методы изучения риккетсий
- •16.2. Методы изучения хламидий
- •16.3. Методы изучения микоплазм
- •Раздел II. Основы санитарной микробиологии
- •Тема 17. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха (17.1) и почвы (17.2)
- •17.2. Санитарно-микробиологическое исследование почвы
- •Санитарно-бактериологические показатели почвы
- •Тема 18. Санитарно-микробиологическое исследование воды
- •Тема 19. Подведение итогов санитарно-микробиологического исследования воздуха, почвы и воды (19.1). Санитарно-микробиологическое исследование мяса (19.2)
- •19.1. Методы количественного определения микробов в исследуемых объектах
- •19.2. Санитарно-микробиологическое исследование мяса
- •Тема 20. Санитарно-микробиологическое исследование молока (20.1) и кисломолочных продуктов (20.2)
- •Классификация молока по редуктазе
- •Показатели бактериальной чистоты питьевого молока
- •20.2. Санитарно-микробиологическое исследование кисломолочных продуктов
- •Раздел III. Серологическая диагностика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных
- •Тема 21. Реакция преципитации: кольцепреципитации (21.1), диск-преципитации (21.2), диффузионной преципитации (21.3)
- •21.1. Реакция кольцепреципитации
- •21.2. Реакция диск-преципитации
- •21.3. Реакция диффузионной преципитации (рдп)
- •Тема 22. Реакция агглютинации: пробирочный метод (22.1). Другие модификации постановки реакции (22.2)
- •22.1. Постановка реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом
- •22.2. Другие модификации постановки реакции. Кольцевая реакция с молоком (кр)
- •Тема 23. Реакция связывания комплемента (рск)
- •Главный опыт рск
- •Задания для самостоятельной работы (для трех занятий)
- •Тема 24. Методы люминесцентной микроскопии
- •Тема 25. Иммуноферментный метод (ифм) диагностики инфекционных болезней
- •Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)
- •Тема 27. Использование в микробиологии днк-зондов
- •Раздел IV. Специальная (частная) микробиология
- •Тема 28. Патогенные стафилококки.
- •Тема 29. Патогенные стрептококки
- •Тема 30. Возбудители эшерихиозов
- •Тема 31. Возбудители сальмонеллезов
- •Тема 32. Возбудитель листериоза
- •Тема 33. Возбудитель рожи свиней
- •Тема 34. Возбудитель антропозоонозной чумы
- •Тема 35. Возбудители гемофилезов
- •Тема 36. Возбудитель пастереллеза
- •Тема 37. Возбудитель туляремии
- •Тема 38. Возбудитель бруцеллеза
- •Тема 39. Возбудитель сибирской язвы
- •Тема 40. Патогенные анаэробы – возбудители эмфизематозного карбункула (40.1), злокачественного отека (40.2), брадзота овец (40.3), инфекционной анаэробной энтеротоксемии (40.4)
- •40.1. Возбудитель эмфизематозного карбункула (эмкара)
- •40.2. Возбудители злокачественного отека
- •40.3. Возбудитель брадзота овец
- •40.4. Возбудитель инфекционной анаэробной энтеротоксемии
- •Тема 41. Патогенные анаэробы – возбудители столбняка (41.1), ботулизма (41.2), некробактериоза (41.3), копытной гнили (41.4)
- •41.1. Возбудитель столбняка
- •41.2. Возбудитель ботулизма
- •41.3. Возбудитель некробактериоза (фузобактериоза)
- •41.4. Возбудитель копытной гнили
- •Тема 42. Возбудители туберкулеза (42.1) и паратуберкулеза (42.2)
- •42.1. Возбудитель туберкулеза
- •42.2. Возбудитель паратуберкулеза
- •Тема 43. Возбудитель актиномикоза
- •Тема 44. Возбудитель сапа
- •Тема 45. Возбудитель лептоспироза
- •Тема 46. Возбудитель кампилобактериоза (вибриоза)
- •Тема 47. Возбудитель дизентерии свиней
- •Тема 48. Возбудители микоплазмозов
- •Тема 49. Возбудители риккетсиозов
- •Тема 50. Возбудители хламидиозов
- •Тема 51. Возбудители микозов
- •Тема 52. Возбудители микотоксикозов
- •Задания для програмированного контроля знаний студентов по частной ветеринарной микробиологии
- •Ответы на задания для программированного контроля по разделу «Частная микробиология»
- •Оглавление
Тема 22. Реакция агглютинации: пробирочный метод (22.1). Другие модификации постановки реакции (22.2)
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать представление о сущности реакции агглютинации, применение ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов: освоить методы постановки реакции объемным (пробирочным) и капельным методами.
Ознакомить с различными модификациями проведения реакции агглютинации.
МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Пробирки агглютинационные в штативе, пипетки на 1 и 5 мл, резиновые груши, физиологический раствор в колбах, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки, единый бруцеллезный антиген для РА и РСК.
Предметные стекла, глазные пипетки, сальмонеллезный антиген и специфически сыворотки.
Для демонстрации: аппарат Флоринского, пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком на бруцеллез; плестиглазовые панели с гемагглютинацией; Роз-бенгаловая проба (РБП) на бруцеллез.
Агглютинацией называется склеивание микробных или других клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролитов. Двухфазный характер этого взаимодействия ничем не отличается от механизма других двухкомпонентных реакций иммунитета: первая фаза – соединение бактерий с антителом; вторая – соединение бактерий под влиянием солевого раствора. Антиген, вступающий в реакцию, носит название агглютиногена, антитела сыворотки – агглютинины, а комплекс антигена + антитело, выпадающий при положительной реакции – агглютинат.
Реакция агглютинации используется для серологической диагностики многих инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, сапа, листериоза, кампилобактериоза и др.
Она проводится с двумя целями для:
а) обнаружения специфических антител в исследуемых сыворотках;
б) установления вида (серогруппы, сероварианта) выделенного микроорганизма (антигена) из патологического материала с использованием известных сывороток, содержащих специфические антитела.
Агглютинация происходит при температуре 37°С в слабощелочной солевой среде.
Различают следующие виды по характеру агглютинации:
1. Соматическую, когда происходит склеивание и оседание неподвижных, не имеющих жгутиков, микробов. Эта форма О-агглютинации протекает медленно, в течение 18-24 ч и дает плотный мелкозернистый осадок, который при встряхивании разбивается на мелкие зерна.
2. Жгутиковую, когда происходит склеивание и оседание подвижных, имеющих жгутики, микробов. Эта форма Н-агглютинации происходит значительно быстрее, уже через 2-4 ч, и дает рыхлый осадок, который при встряхивании легко разбивается на крупные хлопья.
Существует много вариантов постановки реакции агглютинации. Наиболее распространенными методами являются: развернутая реакция агглютинации, которая проводится в пробирках с различными разведениями сыворотки; на предметных стеклах (капельная, пластинчатая: кровяно-капельная гемагглютинация; кольцевая проба (реакция) с молоком, Роз-бенгалевая проба (РБП) и др.).
Компонентами для постановки реакции агглютинации с исследуемыми сыворотками являются:
1. Исследуемая сыворотка крови.
Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней из ушной или хвостовой, у лисиц и песцов – из бедренной вены, у норок – путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста) в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Сыворотки крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30°С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробы выдерживают при +4-10°С. Через 20-24 ч отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.
Сыворотки консервируют:
- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора карболовой кислоты на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании;
- сухой борной кислотой (2-4 % к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 дней со дня взятия крови с сохранением их при +4-8 °С. Сыворотки, консервированные карболовой или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию не подлежат.
В зависимости от вида диагностируемой болезни для проведения реакции агглютинации исследуемые сыворотки разводят физиологическим раствором согласно наставлению.
2. Известный антиген представляет из себя взвесь убитых, реже живых бактерий в физиологическом растворе в определенной концентрации. Антигены изготовляют и стандартизируют на биопредприятиях.
3. Физиологический раствор, который представляет из себя 0,85%-ный раствор поваренной соли.
Для контроля РА используют компоненты:
1. Позитивная (положительная) сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного животного.
2. Негативная (отрицательная) – сыворотка крови здоровых животных, изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории.
Компонентами для постановки реакции агглютинации для определения вида микроба с использованием известных специфических сывороток являются:
1. Диагностические агглютинирующие сыворотки, которые получают путем гипериммунизации кроликов, реже – других животных. Им вводят подкожно 5-7 раз, а затем внутривенно в возрастающих количествах взвесь убитых, а последние три инъекции — живых микробов.
Интервалы между инъекциями колеблются от двух до пяти-семи дней. Через неделю после окончания иммунизации производят пробное взятие крови и ставят реакцию агглютинации для определения титра сыворотки. Если титр антител в сыворотке крови недостаточно велик, иммунизацию продолжают. При наличии высокого титра производят массивное взятие крови или полное обескровливание животного с целью получения сыворотки.
Диагностические наборы для проведения реакции агглютинации выпускаются биопредприятиями.
2. Исследуемый антиген, в качестве последнего используют взвесь микробов. Для этого суточную или 20-часовую изучаемую культуру на скошенном МПА смывают 5 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и переносят в чистую пробирку.
При постановке капельным методом антигеном служит микробная культура.
3. Физиологический раствор поваренной соли.