2. Определение протеолитических свойств

Наиболее часто для обнаружения протеолитических ферментов производят посев чистой культуры бактерий уколом в столбик мясо-пептонного желатина. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22 °С) в течение нескольких дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер.

Рис. 30. Проявление роста (А) и характер разжижения (Б) мясо-пептонного желатина различными бактериями: протеолитический фермент отсутствует: 1 – аэроб; 2 – анаэроб; 3 – факультативный анаэроб; протеолитический фермент в незначительном количестве: 4 – факультативный анаэроб; 5 – анаэроб; 6 – аэроб

Разжижение может быть послойное, что характерно для синегнойных бактерий, стафилококки – в виде «чулка». Характер разжижения желатина возбудителем сибирской язвы напоминает перевернутую елочку (рис. 30).

Протеолитическое действие микроорганизмов можно наблюдать при посевах на свернутую сыворотку крови, вокруг колоний появляются углубления и зоны разжижения.

В молоке наблюдается просветление или растворение образовавшегося вначале сгустка казеина, который расщепляется с образованием пептона, что придает молоку желтоватый цвет (пептонизация молока).

Показателями более глубокого расщепления белка являются его конечные продукты: индол, аммиак, сероводород и др. Для определения этих газообразных веществ производят посев чистой культуры бактерий в бульон или пептонную воду. В пробирки с засеянной средой между стенкой пробирки и пробкой помещают индикаторную бумагу (рис. 31). Посевы выращивают в термостате в течение 1 – 3 суток.

а) обнаружение индола производится несколькими методами. Наиболее прост и доступен способ Мореля. Узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (индикаторная бумага) и высушивают. При выделении индола на 1-3-й день нижняя часть полоски бумаги вследствие соединения индола с щавелевой кислотой приобретает розовый цвет.

б) обнаружение аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумаги, помещенной в пробирку таким же образом, как и для определения индола.

Рис. 31. Определение протеолитических свойств бактерий: изменение цвета индикаторной бумаги при образовании сероводорода, аммиака, индола – до посева (А), положительная реакция (Б)

в) обнаружение сероводорода. В пробирку с посевом помещают индикаторную полоску фильтровальной бумаги, смоченную раствором уксуснокислого свинца. При взаимодействии сероводорода и уксуснокислого свинца бумага чернеет за счет образования сернистого свинца.

3. Определение редуцирующей (восстанавливающей) способности

Для этой цели используют метиленовую синь, тионин, лакмус, нейтральный красный и др. К МПА и МПБ прибавляют раствор одного из указанных красителей. При наличии у бактерий редуцирующей способности среда обесцвечивается. Наиболее широкое применение имеет среда Ротбергера (МПА с 1% глюкозы и несколькими каплями насыщенного раствора нейтрального красного). При положительной реакции красный цвет среды переходит в желтый.

4 Определение фермента каталазы

Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный кислород. Для обнаружения каталазы на поверхность 24-часовой культуры на скошенном МПА наливают 1-2 мл 1%-ного раствора перекиси водорода. Появление пузырьков газа при наклонном положении пробирки регистрируется как положительная реакция. В качестве контроля следует параллельно исследовать культуру, заведомо содержащую каталазу.

5. Определение плазмокоагуляции

Является одной из наиболее надежных проб для выявления пато-генности стафилококков. Для ее постановки разливают по 1-2 мл стерильной плазмы, вносят бактериологической петлей культуру бактерии и помещают в термостат. Проверяют результаты через 30 мин, 2, 4 часа и на другой день. При положительной реакции происходит коагуляция (свертывание плазмы).

6. Определение ДНК-азы

К расплавленному МПА добавляют навеску ДНК из расчета 2 мг на 1 мл среды. Посевы проводят в виде полоски и помещают в термостат на 18-24 часа. На выросший стафилококк наливают 5-6 мл н. НСl. Присутствие в культуре фермента, расщепляющего ДНК, выявляется образованием прозрачных зон вокруг колоний стафилококка.

7. Определение гемолитической способности.

Исследуемую культуру засевают на поверхность кровяного МПА. Для приготовления этой среды к 2%-ному расплавленному и охлажденному до 45°С МПА вносят 5% дефибринированной крови лошади, барана или кролика.

Культивирование проводится при 37°С в течение 24 – 48 часов.

Вокруг колоний микробов, вырабатывающих гемолизин, образуются зоны просветления вследствие растворения эритроцитов. Различают -гемолиз, когда колонии окружены зоной, окрашенной в зеленый цвет, и β-гемолиз при бесцветной зоне.

Задания для самостоятельной работы

1. Освоить методы определения биохимических свойств бактерий на демонстрационных микробных культурах. Определить каталазообразование у бактерий (на предметном стекле с агаровой культурой, в пробирке – с бульонной).

2. Продолжить выделение чистой культуры бактерий (3-й день исследования). Из колоний выделенных бактерий (кишечной палочки, стафилококка, вакцинного штамма сибиреязвенной палочки) приготовить мазки и окрасить их по Граму. Провести микроскопию. Из этой же колонии сделать пересев на МПА и МПБ.

3. Все полученные результаты внести в бланк экспертизы.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Культуральными свойствами бактерий называют:

А. Способность их ферментировать углеводы.

Б. Характер роста их на питательных средах.

В. Вызывать гибель лабораторных животных.

2. При выращивании бактерий на питательной среде с добавлением 10 % крови вокруг колоний образовались прозрачные зоны. Какими ферментативными свойствами обладает данный вид бактерий?

А. Сахаролитические.

Б. Протеолитические.

В. Гемолитические.

Г. Восстанавливающие.

3. В какую из нижеперечисленных питательных сред засевают микробную культуру для выявления сахаролитических свойств?

А. Кровяной МПА.

Б. Свернутая кровяная сыворотка.

В. Молоко.

Г. На среды Гисса (цветной ряд).

4. Как определить выделение сероводорода, образовавшегося при выращивании бактерий, обладающих протеолитическими ферментами?

А. По запаху.

Б. Полоской индикаторной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

В. Полоской индикаторной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца.

Г. Полоской розовой лакмусовой бумаги.

5. В какую из перечисленных питательных сред высевают микробную культуру для выявления протеолитических ферментов?

А. Кровяной мясо-пептонный агар.

Б. МПЖ.

В. Молоко.

Д. На среды Гисса (цветной ряд).

6. Как определить наличие аммиака, образующегося при выращивании бактерий, обладающих протеолитическими ферментами?

А. По запаху.

Б. Полоской индикаторной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца.

В. Полоской индикаторной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Г. Полоской розовой лакмусовой бумаги.