Микробиологическая диагностика менингита

Объектом исследования является спинномозговая жидкость (для установления диагноза менингита). Исследованию подвергается также слизь из носоглотки больных и здоровых лиц при обследовании на бактерионосительство, кровь при подозрении на сепсис, а также органы людей, умерших от менингококковой инфекции. При исследовании любого материала необходимо помнить о крайней лабильности менингококка и предусмотреть все условия для сохранения: производить исследование как можно быстрее, при доставке защищать материал от холода, в лаборатории хранить его в термостате до исследования.

Спинномозговую жидкость получают при соблюдении асептических условий путем люмбальной пункции. Жидкость при менингите мутная, так как содержит гнойные клетки и выходит струей под большим давлением (в норме жидкость прозрачная и вытекает по каплям, медленно).

Схема №7. Микробиологическое исследование при менингококковой

Инфекции и бактерионосительстве (по Борисову л.Б., 2001 г.)

Ликвор, слизь из зева и носа, кровь, гной,

экссудат

Ликвор

Сыворотка крови

Бактериоскопическое Бактериологическое Серодиагностика

исследование исследование

1 этап Мазок, окраска Посев на сыво- В реакции РПГА

по Граму роточный пита- встречного

сыворотками тельный агар иммуноэлектрофореза

Люминесцентная преципитирующими

микроскопия мазков, антименингококковыми

обработанных сыворотками

Ответ

флюоресцирующей

иммунной

сывороткой

2 этап Характер Посев на сывороточный

колоний питательный агар

(чистая культура)

3 этап Мазок,

Определение окраска по Посев на Серотипи-

чувствительности Граму «пестрый» рование

к антибиотикам ряд культуры

Окончательный ответ

Спинномозговую жидкость берут в количестве 2-5 мл и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдерживают при 37^оС для накопления бактерий.

Из исследуемого материала готовят мазки и производят посевы.

Бактериоскопическое исследование. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве случаев обнаруживаются типичные, грамотрицательные диплококки, имеющие характерное расположение – внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менингококковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейсcерии - Branchamella и др. Дифференцировать их по морфологической картине мазка не представляется возможным.

Для экспресс - диагностики и выявления менингококков в исследуемом материале используется также метод флюоресцирующих антител.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержащим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость. Кроме того, используют данную среду с добавлением антибиотика ристомицина (150 ЕД/мл.), который задерживает размножение грамположительных кокков, содержащихся в исследуемом материале, и тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблюдается через 48 часов после инкубации посевов при 37⁰C. В отличие от других кокков, колонии менингококка величиной с булавочную головку, прозрачны имеют голубоватый оттенок и ровные края. Такие колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сапрофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят по ряду признаков. Так, менингококки растут только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах и образуют пигмент, на средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк ферментируют глюкозу и мальтозу до кислоты.

Фаготипирование менингококка проводят для эпидемиологического анализа. Определение серовара производят в реакции агглютинации в пробирках.

Серологическое исследование. Для экспресс – диагностики с целью обнаружения в спинномозговой жидкости специфического полисахаридного менингококкового антигена используется метод встречного иммуноэлектрофореза.

В агаровых пластинках на стекле размером 9×12 см вырезают два параллельных ряда около 3 мм . В лунки одного ряда вносят исследуемую жидкость, в лунки другого ряда – преципитирующие менингококковые сыворотки разных серогрупп.

Для реакции используется веронал – мединаловый буфер. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40- 45 минут при комнатной температуре и силе тока около 30 А. При положительном результате между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой образуются 1-2 полосы преципитации.

Для подтверждения диагноза и при серологическом обследовании больных используют также РПГА с парными сыворотками.

Гонококки

Гонококк - морфологически сходный с менингококком диплококк бобовидной формы, в культуре принимающий вид разрозненных полиморфных кокков. Неподвижен, не имеет спор, не образует капсул, по Граму красится отрицательно. В гнойном отделяемом типичное расположение гонококка внутри лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз).

Для гонококка характерна крайняя нестойкость при воздействии физических и химических агентов: он погибает уже при температуре 40-41˚; даже в гное гонококк гибнет уже через несколько часов. Губительно действуют на гонококк и нитрат серебра в концентрации 1 : 1000, 1% раствор фенола, 0,05 % раствор биглюконата хлоргексидина. Чувствительны микроорганизмы и к антибиотикам - пенициллину, тетрациклину, эритромицину. Однако высокая заболеваемость гонореей в последние годы и самолечение больных привели к широкому распространению гонококков, устойчивых к сульфаниламидам и антибиотикам.

Гонококк чрезвычайно требователен к питательной среде; при выделении из организма растет только на средах с добавлением человеческого белка (асцитической жидкости, сыворотки, или крови). Растут лучше при содержании в атмосфере 3-10% СО₂. На асцит агаре гонококки образуют прозрачные колонии с ровными краями и блестящей поверхностью. Биохимические свойства слабо выражены – из углеводов гонококки расщепляют только глюкозу, образуют каталазу и оксидазу. Протеолитической активностью не обладают.